Yüksek zenginleştirilmiş Nöronal Kültürlerin Üretimi için Kortikal Doku Blokları, Kriyoprezervasyon

Merhaba, benim adım Alan ve California Üniversitesi Irvine, Nörobiyoloji ve Davranış Bölümü'nde Dr. Horney Lu'nun laboratuvarındayım. Ben de Bob. Bugün Dr. Haro, yüksek kaliteli primer nöronal kültürlerin ardından gelen dejenerasyonu için kortikal doku bloklarının rutin kriyoprezervasyonuna yönelik hızlı, verimli ve güvenilir bir protokolü sizlere gösterecek.

Hadi başlayalım. Temizlenmiş ve doğranmış dokular, %10 TMSO içeren dondurma ortamı bulunan kriyoviyallere yerleştirilir.

Kriyo tüpler bir dondurma kabına yerleştirilir ve en az dört saat boyunca negatif 80 °C'de tutulur. Dondurulmuş kriyo tüpler daha sonra uzun süreli saklama için sıvı azota yerleştirilir. Kültürleme işlemi için AC kriyo tüpü, sıcak su banyosunda eritilir ve kalan DMSO'yu uzaklaştırmak için sıcak HBSS ile durulanır.

Dissosiyasyon için triptsin ile birlikte taze HBSS eklenir, ardından %10 EBS içeren DMM eklenir. Dissosiyatif enzimatik aktiviteyi durdurmak için hücreler santrifüjle çöktürülür ve pellet, %10 EBS eklenmiş taze DMM içinde yeniden süspanse edilerek önceden poli-lizin ile kaplanmış kaplara ekilir. 24 saat sonra, DMM takviye edilmiş nörobazal besiyeri ile değiştirilir ve hücreler 10 gün boyunca büyütülür.

Bu protokol, kortikal dokuyu kullanmadan önce doğramak için çelik bir jilet kullanır. Jilet, en az iki saat boyunca %70 etanol ile sterilize edilmelidir. 10 x stok çözeltinin sterilize edilmiş su ile seyreltilmesiyle 1 x Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlanır; hazırlanan 1 x HBSS, doku işlemesine kadar ya buz üzerinde ya da 4 °C'de saklanır.

Dondurma besiyerinde kriyoprotektan olarak dimetil sülfoksit veya DMSO kullanılır. Bu protokolde, 1.X-H-B-S-S-D-M-S-O içerisinde %10 hacimce hacme DMSO dilüsyonu kullanılır; 4 °C'de saklanmadan önce tamamen karıştırılmalıdır. Numunelerin donma hızını kontrol etmek için Nalgene dondurma kabı kullanılır.

Dondurma kabı, önceden etiketlenmiş 2,5 milliliter kriyoviyallerle doldurulur. Birden fazla dondurma kabınız varsa, kapların kendisini de etiketlemek ve safra üzerindeki karşılık gelen kabı not etmek iyi bir fikirdir. Önceden soğutulmuş %10 DMSO, dondurma medyumu ve dondurma kabı steril bir biyolojik güvenlik kabinine alınır.

Burada, her bir kriyoviyale bir mililitre dondurma medyumu yavaşça eklenir. Kapakların sıkıca kapandığından emin olduktan sonra, viyallerin bulunduğu dondurma kabını doku işlemeden hemen önce en az iki saat boyunca dört derece Celsius'ta bekletin. Önceden sterilize edilmiş jiletin iyice durulanması gerekir. Üç kez, üçer dakikalık yıkamalar yapın.

Kalan etanolü uzaklaştırmak için sterilize edilmiş su kullanmak yeterli olacaktır. Jilet, steril suda uzun süre bekletildiğinde oksidasyona eğilimli olduğundan, bu yıkama işlemi hızlıca gerçekleştirilmelidir. Temizleme işleminden önce doku, bir buz paketinin üzerine yerleştirilmelidir.

Serbest yüzen kalıntıları uzaklaştırmak için soğuk one X-H-B-S-S ile hafifçe durulayın. Doku parçalarını kalan membranlardan ve kan damarlarından temizlemek için sterilize edilmiş iğneler kullanılır. Temizleme işlemi sırasında dokunun yapısal bütünlüğünü korumaya özen gösterilmelidir.

Bu işlem arttıkça, temiz dokunun doğranma verimliliği çiğ dokudan belirgin şekilde farklı olacak ve membranların veya kan damarlarının çoğunun uzaklaştırılmış olması gerekecektir. Doku temizlenip durulandıktan sonra doğrama işlemine başlanabilir. Dokuyu yaklaşık bir milimetreküp boyutunda bloklar oluşturacak şekilde temiz kesimlerle doğramak önemlidir.

Çok büyük olan bloklar, çözme sırasında daha düşük hücre verimine neden olur. Ancak küçük bloklarda aşırı işlemeden de kaçınılmalıdır. Parçalanmış doku, bir otomatik pipet ve bir miktar soğuk one X-H-B-S-S kullanılarak toplanabilir.

Toplanan tüm dokuyu geri kazanmak için kabı HBSS ile duruladığınızdan emin olun. Ardından doku, yüksek hacimli 1X HBSS içerisine eklenir ve tabana çökerek gevşek bir pelet oluşturmasına izin verilir. Bu işlem, doku HBSS içinde çökerken mevcut olabilecek tüm kalıntıları temizler; doku paylaştırılmadan önce daha önce soğutulmuş olan dondurma kabını ve kriyoviyalleri hazırlayın.

Doku doldurma işlemini hızlandırmak için tüm flakonların kapaklarını açtığınızdan emin olun. Oda sıcaklığında DMSO'ya maruz kalma süresi 10 dakikayı geçmemelidir. Tüm dokular kullanılana kadar her seferinde tek bir dondurma kabı ile çalışmak uygun olacaktır.

Gevşek doku süpernatını, pelete zarar vermeden, pelete mümkün olduğunca yakın bir noktadan aspire etmeye başlayın. Ardından, pipete 200 microliter geniş ağızlı bir uç takın. Doku bloğu peletinin tabanına inecek blokların yapısını bozacağı için daha dar ağızlı bir uç kullanmayın.

200 microliters dokuyu yavaşça toplayın. Bu dokuyu bir kriyoviyale ekleyin ve tüm viyaller dolana kadar bir sonrakine geçin. 10 dakikalık kural gerekebilir.

Dondurma kabını, içinde kriyoviyaller bulunan -80 °C bir dondurucuya hızla yerleştirin ve zaman kısıtlıysa en az dört saat veya gece boyunca bekletin. Yeterli süre geçtikten sonra dondurma kabını dondurucudan çıkarın ve kriyoviyalleri mümkün olan en kısa sürede bir kriyokutuya aktarın. Uzun süreli saklama için kriyokutuyu bir sıvı azot kutu rafına yerleştirin.

Sıvı azot içerisinden bir kriyotüpü mümkün olan en kısa sürede çıkarın; kriyokutuların oda sıcaklığına maruz kalmasını sınırlayın. Örneği 37 °C'lik bir su banyosuna daldırarak hızla eritin. Kapağın her zaman su seviyesinin üzerinde kaldığından emin olun. Sık sık kontrol edin ve küçük bir buz parçası gözlemlenene kadar çözdürmeye devam edin.

Güvenlik kabinine yerleştirmeden önce, kriyoviyali %70 etanol ile sterilize edin. Eğer kriyoviyalin çeperlerinde doku kalmışsa, çözülmüş dokuyu geniş hacimli ılık 1X HBSS içerisine ekleyin. HBSS ile nazikçe toplayın.

Tüm dokular toplandıktan sonra, tüpü üç ila dört kez ters çevirin ve dokunun dibe çökmesini bekleyin. Bu adım, DMSO'nun yeterli düzeyde seyreltilmesini sağlar.

Doku çöktükten sonra, süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını aspire edin. Ardından buna 10 milliliters ılık, taze 1X HBSS ekleyin. 300 microliters %0,25 tripsin ve 50 microliters DNase ekleyin.

Dokuyu hafifçe çalkalayarak ayrıştırma işlemine devam edin; doku ayrıştığında bulanık bir hücre süspansiyonu oluşacaktır. Sıcak DMEM artı %10 zenginleştirilmiş sığır serumu ekleyerek enzimatik aktiviteyi durdurun. Hücre süspansiyonlarını 1200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini taze DMEM artı %10 EBS içinde yeniden süspande edin ve polilizin kaplı plaklara ekim yapın.

Hücrelerin kaplara tutunması için 30 dakika bekleyin. Ardından medyumu taze %10 EBS içeren DM ile değiştirin. 24 saat sonra, DM içeren medyumu N2 ve B27 ile takviye edilmiş nörobazal medyum ile değiştirin ve 10 gün boyunca büyütün.

Kortikal doku bloklarının rutin kriyokorunumu ile kapsamlı, verimli ve güvenilir bir protokolü detaylandırmış olduk. Başarılar dileriz.