Bilinçli Rat hiperinsülinemik öglisemik Kelepçe

Bu prosedürün genel amacı, bilinci açık ve serbest durumdaki sıçanlarda insülin duyarlılığını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle sol karotis arterinin kateterize edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, optimal sonuçlar elde etmek için sağ juguler ven kateterize edilir.

Beş günlük postoperatif iyileşme süreci boyunca açıklığı korumak için kateterler her gün yıkanır. Nihayetinde, tüm vücut glukoz infüzyon hızlarını gösteren hiperinsülinemik glisemik klempten sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek fizyolojik insülin seviyelerinde tüm vücut glukoz kullanım hızlarının doğrudan ölçümlerinin elde edilebilmesidir.

Arteriyel ve venöz kateterler, cerrahi işlemden önce hazırlanmalıdır. Kateter uçları küt olmalı, heparinli serum fizyolojik ile doldurulmalı ve arteriyel ile venöz kateterler için sırasıyla bir uçtan 2,7 veya 3,2 cm mesafeye güvenli bir şekilde sabitlenmiş bir tutucu beraberinde etanolle sterilize edilmelidir. Bu prosedürde yaklaşık 300 gram ağırlığında erişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlar kullanılır.

Hayvanın başlangıç ağırlığını kaydedin ve ameliyat sonrası ağırlık artışını izlemek için bu ağırlığı kullanın. Aseptik bir cerrahi alanda çalışın. Sıçanı bir anestezi kutusuna yerleştirerek %3 isof fluorine ile anesteziye alın.

Hayvanı cerrahi alandan uzaklaştırın ve boyun ile omuz çevresindeki tüyleri temizleyerek insizyon bölgesini hazırlayın. Tüyler temizlendikten sonra, anesteziyi yaklaşık %2 isofluorine ile sürdürmek için hayvanı bir burun konisine yerleştirin. Hayvanı cerrahi masaya sabitleyin.

Ayak ve/veya göz reflekslerini kontrol ederek sıçanın tamamen anestezi altında olduğundan emin olun. İnsizyon bölgesini %70 etanol ile temizleyin, ardından Betadine ile ovalayın ve tekrar %70 etanol ile temizleyin. Prosedürün ilk adımı, sternumun 10 milimetre üzerinde küçük bir dikey orta hat insizyonu yapmaktır.

Dokuyu küt diseksiyonla uzaklaştırmak ve sol sternal mastoid kasını açığa çıkarmak için kavisli mikrodiseksiyon pensleri kullanın. Sol karotis arterinin yaklaşık bir santimetresini ortaya çıkarmak için bu kası kenara çekin. Bağ dokusunu nazikçe ayıklarken karotis arterini yerinde tutmak için altına mikrodiseksiyon pensleri yerleştirin.

Artere veya sinire zarar vermeden vagus sinirini arterden ayırmak önemlidir. Sefalik ucu bağlamak için steril 4-0 ipek sütür kullanın. Damarı tırtıklı mikro disseksiyon pensiyle klempleyiniz.

Ligatüre delme işlemini gerçekleştirin. İşlemi 21 gauge ven ejekt çoklu örnekleme luer adaptörü ile tamamlayın. Kateterdeki paslanmaz çelik tıpayı çıkarın ve artere yönlendirmek için steril bir kateter yerleştirici kullanın.

Kateterin sabitlendiğinden emin olmak için pens kullanın. Mikro diseksiyon pensini serbest bırakarak arteri klempleyin ve kateteri boncuğa kadar yerleştirmeye devam edin. Bu noktada, kateterin ucu aortik arkta olmalıdır.

Boncuğun altına iki, üstüne bir dikiş atarak sabitleyin ve hattı mililitre başına 10 ünite heparinli salin ile yıkayın. Kateterin örnekleme yapacağını doğrulamak için kateterin dış ucunu paslanmaz çelik bir tıpa ile tekrar kapatın. Ardından, sağ eksternal juguler veni açığa çıkarmak için dokuyu künt diseksiyonla ayırın, veni dikkatlice izole edin ve sefalik veni ligatize edin.

İpek sütürle bitirin. Venü 21 gauge bir iğne ile delin. Multis örnekleme lümen adaptörünü yerleştirin.

Kateterdeki paslanmaz çelik tıpayı çıkarın ve kateteri boncuğa kadar yerleştirmek için steril bir kateter yerleştirici kullanın. Boncuğun altına iki, üstüne ise bir sütür sabitleyin. Ardından hattı mililitre başına 10 ünite heparin içeren buzlu serum fizyolojik ile yıkayın.

Kateterin örnekleme yapacağını doğrulamak için, kateterin dış ucunu 14 gauge küt uçlu bir iğne kullanarak paslanmaz çelik bir tıpayla tekrar kapatın, iğneyi deri altından tünelleyin ve kürek kemikleri arasında sırtta bir insizyon yapın. Ardından, kateterleri iğnenin içinden sırt bölgesinden çıkacak şekilde geçirin. Her bir kateterin yaklaşık dört santimetresi görünür olmalıdır.

0,5 santimetre Tigon S 50 HL tıbbi tüp kesin ve bunu her iki eksternalize kateterin etrafına yerleştirin. Venler için mavi, arterler için kırmızı bant ile sabitleyin. Geçirgenliği doğrulamak için kateterleri tekrar test edin, ardından pıhtılaşmayı önlemek için 150 units per milliliter heparinli salin ile yıkayıp doldurun.

Tüm insizyonları 3-0 ipek sütür ile kapatın. Sıçanı, yemeğin kolayca erişilebilir olduğu, önceden ısıtılmış temiz bir kafese yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Sıçan tamamen hareket kabiliyetini ve uyanıklığını geri kazandığında, onu ana kafesine geri götürün.

Sıçanın üç ila beş gün boyunca iyileşmesine izin verin; bu süreçte enfeksiyon, ağrı ve kilo değişimlerini günlük olarak takip edin. Çalışma boyunca kateter açıklığının korunması önemlidir. Ameliyat sonrası her gün, bir mililitrelik slip uçlu şırıngaları mililitre başına 150 ünite heparinli salin ile doldurun ve uçlarını 22 gauge küt uçlu iğne ile kapatın.

Küt uçlu iğne, diğer ucunda 23 gauge paslanmaz çelik boru konnektörü bulunan 20 santimetrelik PE 50 borunun içine yerleştirilir. Hattaki tüm hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun. Sıçandan dışarı çıkarılan arter hattını, tıkaçtan hemen alt kısmından hemostatlar ile klempleyin.

Başka bir hemostat çifti kullanarak çelik kateter tıkacını çıkarın. Şırıngaya bağlı tüp konnektörünü arter hattına yerleştirin ve dışarı çıkarılmış arter kateterini tıkayan hemostatları serbest bırakın. Ardından, kateterdeki arter kanını şırıngaya aspire edin.

Eğer kateterle çekim kolayca yapılamıyorsa, ucu yerinden oynatmak için kateter aracılığıyla çok nazikçe küçük bir miktar solüsyon itmek gerekebilir. Kateterin temizlendiği kabul edilir. Kan şırınga klemcine ulaştığında, bir mililitrelik şırınganın yakınındaki P 50 tüpünü kapatın ve şırıngayı atın.

Taze heparinli buzlu salinle doldurulmuş yeni bir şırınga ile değiştirin. Tüpün klempsini açın ve yeni şırıngayı dik tutarken, hava kabarcıklarını yukarıya, hattın dışına doğru itmek için şırıngaya hafifçe vurun. Kateter hattı temizlenene ve kandan arınana kadar heparinli salin enjekte edin.

Artery hattını, boru bağlantı parçasının hemen altından klemple kapatın. Arteriyel kateter hattındaki şırınga konnektörünü çıkarın ve yerine paslanmaz çelik boru tıpasını yerleştirin. Dışa çıkarılmış arteriyel kateteri kapatan hemostatları serbest bırakın.

Bu prosedürü venöz hat için tekrarlayın. Düşük venöz basınç nedeniyle örnekleme mümkün olmayabilir. Genel olarak, heparinli salin minimum dirençle infüze edilebiliyorsa, kateterin ven içinde iyi konumlandığı muhtemeldir.

Prosedüre başlamadan önce hayvanlar tartılmalı, çözeltiler hazırlanmalı ve klempli düzenek kurulmalıdır. Hayvan tartıldıktan ve kateterin açıklığı doğrulandıktan sonra, hayvanı hareketi kısıtlayan ancak tamamen engellemeyen altlıklı küçük bir kaba yerleştirin. Bu çalışmada kullanılan sıçanlar en az beş saat aç bırakılmış ve ameliyat sonrası kilo alma gerekliliklerini karşılamıştır. Sıçanın ağırlığı, burada gereken insülin miktarını belirler.

Kilogram başına dakika başına dört mili ünite, dakika başına iki mikrolitre hızla uygulanır. %50'lik bir dekstroz çözeltisi hazırlayın ve her iki çözeltiden de yaklaşık iki saat yetecek kadar olduğundan emin olun; burada üç mililitrelik şırıngalar kullanılır. Artık klempleme düzeneğini monte etmeye hazırsınız.

Hatları ve infüzyon pompalarını burada görüldüğü şekilde kurun. Glikoz ve insülin şırıngalarını şırınga pompasına yerleştirin. Hatları klempleyiniz ve deneye başlamadan önce sıçanın 30 dakika boyunca dinlenmesini sağlayın.

Prosedüre başlamak için, başlangıç insülin ve hematokrit örneği alın; hematokrit örneklemesi, deney boyunca kan hacminin korunduğunu sağlar. Genel olarak, hematokrit seviyeleri başlangıç değerinin %10'undan fazla düşmemelidir. Başlangıç glukoz örneği alın ve clamp edilecek glukoz seviyesini belirleyin.

Burada glisemiyi U seviyesinde veya 5 mM olarak sabitliyoruz. Pıhtılaşmayı önlemek için her kan örneğinden sonra arter hattını küçük bir hacimde 10 unit/mL heparinli salin ile yıkayın. Sabitlenecek glikoz düzeyi belirlendikten sonra insülin solüsyonu infüzyonuna başlayın.

Kan glukozunu beş ila 10 dakikalık aralıklarla kaydedin ve kararlı bir durum elde edilene kadar glukoz infüzyon hızını gerektiği şekilde ayarlayın. Bu işlem genellikle deneme yanılma yoluyla gerçekleştirilir ve 30 dakikadan iki saatin üzerine kadar sürebilir. Glisemiyi korumak için gereken glukoz seviyesi, deneysel protokole bağlıdır.

Türlerin ve koşulların klemplenmiş sayılabilmesi için, birbirini takip eden üç okumanın tanımlanmış bir aralıkta olması gerekir. Birbirine yaklaşık bir milimolar yakınlıktaki üç okuma, glikoz seviyelerinin kararlı bir duruma ulaştığını gösterir. Glisemiyi 30 dakikalık bir süre boyunca korumak için gereken glikoz infüzyon hızı belirlenirken, bu süre zarfında en az ek kan örnekleri alınabilir.

Klem prosedürü tamamlandığında ikinci bir plazma insülin hematokrit örneği toplanmalıdır. Hayvanlar daha fazla test için kullanılabilir veya daha sonraki analizler için doku toplamak amacıyla ötanize edilebilir. Hayvana bağlı olarak, doğru şekilde uygulandığında kateter hatları beş ila yedi gün boyunca açık kalabilir.

Klempleme prosedürü, kararlı durum insülin duyarlılığını ölçebilir. İnsülin ve glikoz seviyelerinin yanı sıra glikoz infüzyon hızlarının ve hematokrit değerlerinin kaydedilmesi esastır. Glikoz seviyeleri 30 dakikalık bir süre boyunca birbirine bir milimolar mesafede kaldığında kararlı duruma ulaşılmış olur.

Glikoz infüzyon hızı, mümkün olduğunca glisemiyi korumak için gereken ekzojen glikoz seviyesini ortaya koyar; bu nedenle hız, tek bir ortalama zaman noktası yerine zamana karşı grafiğe dökülmelidir. Hem açlık hem de klemplenmiş insülin seviyeleri rapor edilmelidir. Bu ölçümler, insülinin başarıyla verildiğini doğrular ve tedavi grupları arasındaki insülin yanıtındaki farklılıkları tespit eder; başlangıçta ve prosedürden sonra hematokrit seviyelerinin tekrar ölçülmesi, seviyelerin deney süresince başlangıç değerinin %5'inden fazla düşmediğinden emin olmayı sağlar.

Tüm vücut ve dokuya özgü glikoz kullanımını değerlendirmek için izotopik işaretleyici uygulaması gibi diğer yöntemler kullanılabilir.