İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Bu prosedürün genel amacı, mitokondrileri izole etmek ve mitokondriyal solunumu gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle Sprague Dawley sıçanlarından iskelet kasının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kas homojenize edilir ve santrifüjleme yoluyla mitokondriler izole edilir.

Ardından, Bradford testi kullanılarak protein konsantrasyonu belirlenir. Son olarak, mitokondriyal solunum poligrafy ile ölçülür. Nihayetinde, farklı mitokondriyal solunum durumları üzerinden oksijen tüketimini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyon üzerindeki farklı müdahalelerin etkisi gibi iskelet kası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem iskelet kası metabolizması hakkında bilgi sağlayabilse de, karaciğer, beyin, böbrek veya hemen hemen her doku gibi diğer organlara da uygulanabilir. İşleme başlamadan önce, iskelet kasını izole etmek için şu çözeltileri hazırlayın: PBS, 10 millimolar EDTA içeren PBS, sekiz kat mitokondri izolasyon tamponu veya IB1, izolasyon tamponu iki veya IB2 ve deney tamponu veya eb.

Talimatlar için ekteki yazılı protokole bakınız. Ardından, santrifüjü açın ve 4 °C'ye ayarlayın. Bir benmariyi açın ve 37 °C'ye ayarlayın.

Uygun bir kovaya üç adet 10 mililitrelik beher, potter dirseği, doku eziciler, küçük cerrahi makaslar ve 10 adet mikro santrifüj tüpünü buz üzerine yerleştirin. Deney boyunca her şey buz gibi soğuk kalmalıdır. IB bir ve IB iki'yi BUZ üzerine, EB'yi ise sıcak bir su banyosuna yerleştirin.

Ardından, buz üzerindeki üç behere aşağıdaki çözeltileri ekleyin: birinci beher için 10 milliliters PBS, ikinci beher için 10 milliliters P-B-S-E-D-T-A, üçüncü beher için 3 milliliters ib. 1. Yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komiteniz tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak bir sıçanı ötanize edin.

Ardından, forseps ve mayo makası kullanarak 250 ila 500 miligram iskelet kasını hızla izole edin. Kas dokusunu beca birde durulayın, ardından homojenize etmek için beca ikiye aktarın. İlk olarak beher üçe aktarın ve son olarak makasla incece kıyın.

Çözeltiyi potter Elva gem homojenizatörüne aktarın ve tüpü her zaman buz üzerinde tutarak, motorlu bir havan eli kullanarak kas dokusunu 10 kez homojenize edin. Ardından, homojenatı önceden soğutulmuş iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 700 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüpüne aktarın ve pellet kısmını atın.

S süpernatantını 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.500 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı önceden hazırlanmış yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve üzerine SN1 ve kas tipi şeklinde etiketleyin. Peleti 500 µL IB2 içerisinde süspanse edin, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.500 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı önceden hazırlanmış yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve üzerine SN2 ve kas tipi şeklinde etiketleyin.

Final mitokondriyal peleti 100 µL IB iki içinde süspande edin. Bir mini santrifüjde birkaç saniye döndürün. Eğer bir pelet oluşmuşsa, süpernatantı yeni bir önceden doldurulmuş mikro santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın. Oksijen elektrodunun kalibrasyonu bu protokolde kritik bir adımdır ve günlük olarak gerçekleştirilmelidir.

Elektrodun kalibrasyonu, mitokondri izolasyonu sırasında tamamlanabilir. Başlamak için, 250 mililitrelik bir erlene 100 mililitre distile su ekleyin ve 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Suyun atmosferik gazla dengelenmesi için, GRAT elektrodunu birkaç damla %50 potasyum klorür ile kaplayın.

Ardından, elektrodun üzerine küçük bir parça mavi rizla sigara kağıdı yerleştirin. Sonra, sigara kağıdının üzerine bir parça PTFE membran koyun.

Halka aplikatörünü kullanarak iç halkayı uygulayın ve ardından dış halkayı elektrot oluğuna yerleştirin. Elektrotları bağlayın; daha büyük plastik halka tabanını, mitokondriyal hazneyi ve su hortumlarını monte edin. GRAT kutularını açın ve GRAS yazılımını başlatın.

Dengelenmiş suyu mitokondriyal hazneye ekleyin. Ardından, karıştırıcıyı çalıştırmak için bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Donanım (hardware) seçeneğine tıklayın.

Ardından düşük hızda karıştırın. Hızı 60'a ayarlayın ve tıklayın. Sonra, yeni bir deneye başlayın.

Kalibre et'e ve ardından sıvı faz kalibrasyonu'na tıklayın. Birinci kutu için sıcaklığı 37 °C olarak değiştirin ve iki kez tamam'a tıklayın. Geçersiz kıl seçeneği tamam şeklinde değiştiğinde, buna tıklayın ve azot gaz tankını açın.

Azot tankına bağlı ucu hazneye yerleştirin ve sıfır oksijen seviyesini sağlayın. Sistem geçersiz kılma (override) modundan çıktığında tamam'a tıklayın. Suyu aspire edin ve mitokondri haznelerine 500 µL EB ekleyin.

Hazneyi bir pistonla sızdırmaz hale getirin. Birden fazla kutu kullanılıyorsa, her kutu için kalibrasyon adımından itibaren işlemi tekrarlayın. Yeni bir deney başlatın ve yaklaşık bir dakika boyunca çalışmasına izin verin.

Sinyali stabilize etmek için, her bir bölmede 150 mikrogram olacak şekilde gerekli hacimde mitokondri süspansiyonu ekleyin. Olayı işaretleyin ve çalışmaya bırakın. Bir dakika boyunca, son konsantrasyonu beş milimolar glutamat ve 2,5 milimolar malat olacak şekilde 10 mikrolitre sıcak 250 milimolar glutamat ve 125 milimolar malat ekleyin, işaretleyin ve bir dakika boyunca çalışmaya bırakın.

Bu durum, ikinci durum olarak tanımlanmıştır. Ardından, nihai konsantrasyon 150 micromolar olacak şekilde 7,5 microliter 10 millimolar a DP ekleyin. Daha sonra işaretleyin ve 30 saniye boyunca çalışmasına izin verin.

Bu durum durum 3 olarak tanımlanır. 10 millimolar ADP'den 7,5 microliters daha ekleyin ve 1,5 dakika boyunca çalıştırın. Final konsantrasyonu bir micromolar olacak şekilde soğuk 10 millimolar oligomycin'den 0,5 microliters ekleyin ve üç dakika boyunca çalıştırın.

Bu durum durum dört olarak tanımlanır. Final konsantrasyonu 0,2 µM olacak şekilde 1 µL soğuk, 0,1 mM FCCP ekleyin ve RUM'un üç dakika boyunca devam etmesine izin verin. Bu durum durum beş olarak tanımlanır.

İşlem tamamlandığında, deneyi sonlandırın ve kaydedin. Raft yazılımını kullanarak solunum hızlarını elde edin. Normalizasyon faktörünü girin.

150 mikrogram mitokondriyal protein ekleniyorsa, normalizasyon faktörü 0,15 olacaktır. Farklı solunum durumları için normalize edilmiş solunum hızlarını hesaplayın. Durum üçü durum dörde bölerek solunum kontrol oranını veya RCR'yi hesaplayın.

Bu şekil, iskelet kası mitokondrilerinin oksijen tüketimine ait temsili bir izleme grafiğini göstermektedir. Elektrot sinyali stabilize olduktan sonra, mitokondri örneği GRAT haznesine eklenir. İkinci aşamada, glutamat ve malat ilavesiyle solunum başlar.

ADP eklenmesi oksijen tüketimini artırır. Durum üçün tanımlanması. Durum dört solunumunu elde etmek için ligamisin eklenerek ATP sentaz solunumu bloke edilir.

Son olarak, mitokondriyal respirasyonu ayırmak için FCCP eklenir. Bu diyagram; 2, 3, 4 ve beş durumları için temsili oksijen tüketim oranlarını göstermektedir. Her deney için solunumsal kontrol oranı veya RCR hesaplanır.

Dört'ten büyük bir RCR, uygulanabilir bir mitokondri hazırlığının kanıtı olarak kabul edilir. Bu prosedür uygulanırken, mitokondri örneklerini her zaman buz üzerinde tutmak önemlidir. Bu prosedürün ardından.

Mitokondriyal protein içeriği gibi ek soruları yanıtlamak için Western blot gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iskelet kasından mitokondri izolasyonunun yanı sıra mitokondriyal solunum hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.