Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, F 7, 000 floresan spektrofotometresinin Mikroplaka okuyucu ile Pico green boyası kullanarak çift sarmallı DNA kantifikasyonu yapma kapasitesini göstermektir. Bu işlem, öncelikle numunelerin ve reaktiflerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise cihazın kurulumudur.

Prosedürün üçüncü adımı, örneklerin Mikroplaka okuyucuya yüklenmesidir. Prosedürün son adımı ise standartların ve örneklerin ölçümünün gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, bilinmeyen örneklerin çift sarmallı DNA miktar tayini için kullanılabilecek lineer bir kalibrasyon eğrisi gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Ksenon lambasının bir saat boyunca ısınmasını sağlamak için Hitachi F 7, 000 Spektra Florimetresini açın. Excel'de standartlar ve örnek verilerini içeren bir dosya oluşturun ve bunu virgülle ayrılmış değerler veya CSV formatında kaydedin. Florimetreyi kurmak için öncelikle analiz yöntemi penceresini açan yöntem butonuna tıklayın.

Ölçüm alanında, açılır menüden fotometriyi seçin. Şimdi kantifikasyon sekmesine tıklayın. Kantifikasyon tipi alanında, floresan okumasının belirli bir dalga boyu kullanılarak yapılacağını belirtmek için dalga boyunu seçin.

Kalibrasyon tipi için birinci dereceyi ve dalga boyu sayısı için biri seçin. Konsantrasyon birimi için nanogram/mililitre girin. Manuel kalibrasyon ve eğriyi sıfırdan geçmeye zorla kutucuklarının işaretli olmadığından emin olun. Ondalık basamak sayısı için ikiyi seçin, alt konsantrasyon sınırı için sıfır ve üst konsantrasyon sınırı alanı için 10,000 girin.

Ardından, cihaz sekmesine tıklayın ve veri modu alanından floresans seçeneğini belirleyin. Kıymama (chopping) hızı alanı, yalnızca fosforesans ölçümleri için kullanıldığından aktif olmadığını doğrulayın. Dalga boyu modu alanında, ex WL alanında WL sabit seçeneğini belirleyin ve EM WL alanına 480 nanometre girin.

520 nanometre girin. EX ve EM altındaki diğer tüm alanları inaktif bırakın. Hem ex yarık genişliğini hem de EM yarık genişliğini 5.0 nanometre olarak ayarlayın.

Açılır menüleri kullanarak, PMT voltajı 1000 volt alanının önündeki kutucuğu seçilmemiş bırakın. PMT voltajı için açılır menüden 700 volt seçeneğini belirleyin. Ayrıca, otomatik istatistik hesaplama sayısı için iki, tekrarlar için bir, entegrasyon süresi için 0.1 saniye ve gecikme için sıfır seçeneğini belirleyin.

Şimdi izleme sekmesini açın ve y ekseni maksimum alanını 10,000, y ekseni minimum alanını ise sıfır olarak ayarlayın. Ardından, veri toplama sonrası veri işlemeyi aç kutucuğunu ve eğer gerekiyorsa, okumalar tamamlandığında raporun otomatik olarak yazdırılması için veri toplama sonrası rapor yazdır kutucuğunu seçin. Son olarak, analiz yöntemi penceresinin farklı sekmelerindeki tüm seçili parametreleri kaydetmek için genel sekmesine tıklayın ve belirtilen bir konumda yeni bir dosya adı altında kaydedin.

Bu pencereyi kapatmak için tamam düğmesine tıklayın. Bu işlemle cihaz test parametrelerinin kurulumu tamamlanmış olur. Mikroplaka okuyucuyu kurmak için, MPR kurulum penceresini ön plana getirmek amacıyla MPR düğmesine tıklayın.

Öncelikle standartlar için kuyucukları seçin. Örneğin, A1 konumuna tıklayın ve fareyi E1'e kadar sürükleyin. Ardından standart seti düğmesine tıklayın.

Bu işlem, yeşil renkle vurgulandığı üzere standartlar için kullanılacak pozisyonları seçecektir. Ardından numuneler için pozisyonları seçin. Benzer şekilde, fareyi plaka üzerindeki karşılık gelen pozisyonların üzerinde tıklayıp sürükleyin ve ardından seçilen pozisyonları otomatik olarak sarı renkle vurgulayacak olan numune seti butonuna tıklayın.

İstenilen örnek ölçüm konumları için aynı işlemi tekrarlamaya devam edin. Standartları ve örnek bilgilerini daha önce hazırlanan virgülle ayrılmış değişken dosyasına yüklemek için MPR kurulum penceresinin kuyu bilgileri sekmesine tıklayın.

Yükleme kuyusu bilgileri butonunu seçin; kuyuk bilgileri dot csv dosyasını belirlemek için bir Windows Gezgini penceresi açılacaktır. Bilgiler yüklendikten sonra, pencere bir tablo şeklinde görüntülenmelidir. Pico green reaktifinin çalışma çözeltisini hazırlamak için, 9.95 milliliters TE tamponuna 50 microliters 200 X pico green reaktifi ekleyin.

Standart eğri için, TE tamponunda final konsantrasyonları 1 ile 100 nanogram/mililitre arasında değişen Lambda çift sarmallı DNA seri dilüsyonları hazırlayın; her bir standarttan 150 mikrolitre miktarını 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenmiş kuyucuklarına pipetleyin. Ardından, her bir test örneğinden 150 mikrolitre miktarını plakanın karşılık gelen belirlenmiş kuyucuklarına pipetleyin. Şimdi, çok kanallı pipet kullanarak her kuyucuğa 150 mikrolitre PicoGreen çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi DNA örnekleriyle karıştırın.

Reaksiyonun gelişmesi için plakayı karanlık bir alanda iki ila beş dakika boyunca nazikçe inkübe edin. MPR kurulum penceresini ekranın üst kısmına getirmek için MPR ekran düğmesine tıklayın ve ardından değişim konumu düğmesine tıklayın. Mikroplaka tutma platformu cihazın önüne doğru hareket edecektir; mikroplaka okuyucunun kapağını açın ve 96 kuyucuklu plakayı, A1 kuyucuğu öne gelecek şekilde tutma platformuna yerleştirip mikroplaka okuyucunun kapağını kapatın.

Mikroplakadaki A konumunu ölçüm konumuna yerleştirmek için başlangıç konumu düğmesine tıklayın. Ölçüm penceresini ekranın üst kısmına getirmek için monitör ekranı düğmesine tıklayın. Standartların ve bilinmeyen numunelerin ölçümünü başlatmak için ölç düğmesine tıklayın.

İyi bir kalibrasyon eğrisi, F 7, 000 yazılımı tarafından sağlanan farklı parametreler kullanılarak değerlendirilir. Örneğin, Pico green boyası kullanılarak çift zincirli DNA'nın kantifikasyonu için elde edilen bu ideal kalibrasyon eğrisinin hesaplanan belirleme katsayısı 0.99993'tür. Tanımlanan yüksek kapasiteli sistem; Pico Green Boyası, Mikroplaka okuyucu ile donatılmış bir Hitachi F 7, 000 floresan spektrofotometre ve veri toplama, depolama, analiz ve sunumu otomatikleştirmek için bir yazılım programını içeren teknolojilerin seri bir kurulumudur.

Güçlü teknolojilerin kombinasyonu, küçük miktarlardaki çift zincirli DNA'nın doğru bir şekilde analiz edilmesine yönelik artan ihtiyacı karşılayabilir.