Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro bir homolog rekombinasyon analizi kullanarak BRCA1 proteinindeki spesifik varyantları test etmektir. Bu, BRCA1'e özgü kısa müdahaleleyici RNA (siRNA) ve test edilen BRCA1 varyant proteinlerinin hücrelerde yeniden ekspresyonu için plazmidin transfeksiyonu yoluyla, endojen vahşi tip BRCA1 proteininin test edilen varyantla değiştirilmesiyle gerçekleştirilir; ikinci adımda, mutant BRCA1'i eksprese eden plazmid ve kısa müdahaleleyici RNA'ya ek olarak, test hücresinin DNA genomunda spesifik bir bölgede DNA hasarına neden olan I SCE1 proteinini eksprese eden bir plazmid eklenir. Ardından, DNA hasarının meydana gelmesi ve onarımın gerçekleşmesi için hücreler iki ila üç gün boyunca inkübe edilir; GFP eksprese eden hücrelerin akış sitometrisi analiziyle, BRCA1 proteininin spesifik protein varyantlarının homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımında işlev görüp görmediğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu teknik, homolog rekombinasyon yoluyla DNA hasarının onarımındaki spesifik protein varyantlarını analiz etmek için çok yönlü bir sistem oluşturmak amacıyla iki yerleşik yöntemi birleştirir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceki yöntemlerin BRCA1 genetik nakavtuna sahip hücre hatlarına dayanmasıdır. Biz, endojen proteinin RNA interferansı ile BRCA1 eksiltilmesine ve bu hücrelere test proteininin geri eklenmesine olanak tanıyan, HELOC hücrelerinden türetilmiş daha yönetilebilir bir hücre hattı kullanıyoruz.

Artık bir varyant BRC1 proteini eksprese ederek homolog rekombinasyonu test edebiliriz. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, prosedür sırasındaki aşırı hücre ölümü nedeniyle zorluk yaşarlar. Sitotoksisiteyi sınırlarken rekombinasyon reaksiyonunun etkisini maksimize eden bir transfeksiyon koşulunun dikkatle ayarlanması önemlidir.

Bu protokolün başlangıcından önce, hela hücrelerinin P-D-R-G-F-P ile transfekte edilmesiyle hela DR 13 dokuz hücre hattı oluşturulmuştur. Hücre hattını, stabil olarak transfekte edilmiş hücrelerin seçimi için purmycin içeren 10 santimetre çapında Petri kaplarında sürdürün. P-D-R-G-F-P plazmidindeki ve stabil transformantlardaki rekombinasyon substratı, GFP'nin iki inaktif alelini içerir. Alellerden biri, ISCE bir için 18 baz çiftlik restriksiyon enzim tanıma bölgesinin dahil edilmesi nedeniyle inaktiftir.

Kodlama dizisinde, bu hücrelerdeki ISCE one ekspresyonu, inaktif GFP'nin ikinci aleli üzerinde çift zincirli bir DNA kırığı veya DSB oluşturur. Dizisinin ilk aleldeki I SCE E one bölgesiyle ilişkili olan kısmı yabanidir. Bu ikinci GFP aleli, DSB'nin homolog rekombinasyon onarımı için bir dizi donörü olarak işlev görebilir ve ilk transfeksiyondan bir gün önce akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilen aktif bir GFP aleli ile sonuçlanır.

En az %90 konfluen durumdaki HeLa DR 13 hücrelerinin bulunduğu 10 santimetrelik bir kap temin edin; hücreleri bir mililitre tripsin ile iki ila üç dakika boyunca inkübe edin. Dokuz mililitre DMEM-FBS ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu pipetleme yaparak iyice karıştırın. 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna, 0,5 mililitre DMEM-FBS içinde 40 mikrolitre tripsinizize edilmiş hücre ekleyin; hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.

Birinci günde, hücreler %40 ile %50 arasında konfluen olmalıdır. Endojen b RCA one'yi tüketmek için kullanılan siRNA ile B RCA one mutant eksprese eden plazmidi optimum medyada karıştırarak transfeksiyona başlayın. Ardından, nükleik asitleri optimum medyadaki lipozomlarla birleştirin.

Transfeksiyon sonrası, üretici talimatlarına göre lipektomi transfeksiyonunu gerçekleştirin. Hücreleri inkübasyona geri bırakın. Dört ila altı saat sonra ortamı, antibiyotik içermeyen bir besiyeri ile değiştirin.

Hücreleri ikinci günde gece boyunca inkübe edilmek üzere geri döndürün. Her bir kuyucuğa 0,3 mililitre trip sin tripzin reaktifi ekleyerek hücreleri tripsinize edin; 37 °C'de kısa bir inkübasyonun ardından, hücreleri tripsin reaktifi içinde pipetle yukarı ve aşağı çekerek gevşetin. Tripsinizasyon tamamlandığında, tripsin aktivitesini durdurmak için hücreleri 24 kuyucuklu plakadan, iki mililitre D-M-E-M-F-B-S içeren altı kuyucuklu bir plakaya aktarın.

Altı kuyucuklu plakayı, ilk transfeksiyondan iki gün önceki ile aynı koşullar altında gece boyunca inkübe edin. SIR A'yı, BRCA one mutant eksprese eden plazmid DNA'yı ve ISCE one eksprese eden plazmidi 62,5 µL Optum içinde hazırlayın. Bu çözeltiyi 2,5 µL LIPECTOMY 2060 ve 2,5 µL Optum ile karıştırın.

Dört ila altı saatlik inkübasyonun ardından hücreleri transfekte etme işlemine geçin. Besiyerini antibiyotik içermeyen D-M-E-M-F-P-S ile değiştirin. Hücreleri altıncı günde inkübatöre geri koyun.

Her kuyucuğa 0,5 mililitre tripsin reaktifi ekleyerek hücreleri tripsinize edin. İki mililitre D-M-E-M-F-B-S ekleyerek reaksiyonu durdurun. Hücreleri oda sıcaklığında, 1000 RPM'de beş dakika santrifüj ederek toplayın. Hücreleri bir mililitre taze D-M-E-M-F-B-S içinde yeniden süspande edin ve GFP ekspresyonu için kuyucuk başına 10.000 hücreyi analiz edin.

Akış sitometrisi ile, canlı tekil hücreler ileri ve yan saçılma parametreleri kullanılarak seçilir. GFP pozitif hücreler GFP floresans dedektörü kullanılarak yönlendirilir ve sonuçlar bir histogram olarak sunulur. Geriye kalan hücreler, floresan görüntüleme için yeniden ekilebilir.

İstenen BRCA1 mikroskopisi, homolog rekombinasyon yoluyla çift zincirli DNA kırıklarının onarım yolağını düzenler. Homolog rekombinasyonla onarım gerçekleşmiş olan hücreler, floresan mikroskopi ile kolayca tespit edilir. RNAi ile BRCA1'in tüketilmesi, tespit edilen GFP pozitif hücrelerin sayısında keskin bir azalmaya yol açar.

FCA'dan elde edilen çıktı, x ekseninde hücre başına GFP yoğunluğu ve y ekseninde hücre sayısının yer aldığı bir histogramdır. Transfekte edilmemiş, ekspresyon plazmidi içermeyen SCE'lerin yokluğunda, GFP pozitif hücre tespit edilmemiştir.

İkinci ile altıncı sütunlar arasındaki sonuçların tamamı, üçüncü günde ISC one ekspresyon plazmidinin transfekte edildiği hücrelerden alınmıştır. Tek bir deneyden elde edilen tipik sonuç setinde, I SCE one ekspresyonu ve ilgisiz bir gen için kontrol RNAi depleksyonu sonrası hücrelerin %15,5'i GFP pozitiftir; buna karşın BRCA one depleksyonu ve boş bir plazmid vektörünün geri eklenmesi, GFP konversiyonunu %0,7'ye düşürmüştür. Ekzojen wildtype BRCA one eklenmesi, %15 ile %16 arasında GFP pozitif hücre elde edilmesiyle tespit edildiği üzere, homolog rekombinasyonu tamamen geri kazandırmıştır.

Benzer şekilde, önemi bilinmeyen başka bir varyantın ekspresyonu. BRCA1 21B mutasyonu, BRCA1 bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonunu tamamen geri kazandırmıştır. BRCA1 M18T mutantının geri eklenmesi, vektör kontrolü ile benzer bir etki göstermiştir.

Bu varyantın endojen proteinle benzer seviyelerde eksprese edilmesi, BRCA1 M18T varyantının homolog rekombinasyonda işlevsiz olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken hücre büyümesinin izlenmesi gerektiğini, hücrelerin yavaş ve düşük konfluens düzeyinde büyüdüğünü ve kullanılan transfeksiyon karışımı miktarının azaltılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ayrıca, transfeksiyon ortamının zamanında uzaklaştırılması da önem taşımaktadır.

Transfeksiyondan sonraki günlerde, besiyerine antibiyotikler eklendiğinde yüksek düzeyde sitotoksisite gözlemledik. Bu nedenle, birinci günden sonraki tüm besiyerleri geliştirme aşamasından itibaren antibiyotik içermemektedir. Bu teknik, meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kanser kliniklerinde klinik önemi bilinmeyen BRC 1 varyantlarının genetiğini incelemelerine olanak sağlamıştır.

Bu çalışmada geliştirilen fonksiyonel BRC one analizinin, BRC one varyantlarının kanser yatkınlığı üzerindeki etkilerinin daha iyi tahmin edilmesine olanak sağlayacağını umuyoruz.