Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, sınırlı bir örneklem içerisinde tarafsız ve temsili veriler toplamak ve dokunun karmaşık üç boyutlu yapısını hassas bir şekilde analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle immünohistokimyasal olarak boyanmış pankreas kesitlerinin sanal dilimlerinin yakalanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, sanal dilimler Image J yazılımındaki IHC sanal dilim makrosu ile nicelleştirilir ve veriler Mathematica için yazılmış betikler ile analiz edilir.

Ardından, Image J kullanılarak sanal kesitlerin 3B rekonstrüksiyonu gerçekleştirilir. Prosedürün son adımı, slide book yazılımını kullanarak bireysel adacık görüntülerinden oluşan bir yığın yakalamak ve stereo investigator kullanarak görüntü yığınlarını üç boyutta manuel olarak haritalandırmaktır. Nihayetinde, 3B görüntüleme ve manuel haritalandırmanın birleşik bir yöntemi aracılığıyla, her bir adacık hücresi için 3B koordinatları içeren hassas adacık mimarisi elde edilebilir. Bu yöntem, fizyolojik ve patofizyolojik durumların pankreas beta hücre kütlesini, adacık dağılımını ve mimarisini nasıl etkilediği gibi obezite ve diyabet çalışmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, beta hücre kütlesindeki değişimlerin daha iyi anlaşılmasının terapötik müdahalelerin geliştirilmesini ve değerlendirilmesini kolaylaştıracak olması nedeniyle, obezite ve diabetes melitus teşhisi veya tedavisine kadar uzanmaktadır. Mevcut çalışmada açıklanan yöntemler özellikle pankreasın dinamik immünohistokimyasal analizine dair içgörü sağlasa da, bu yöntemler diğer birçok organizmaya ve dokuya da uygulanabilir. Bilgisayar destekli analiz adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Bu kadar büyük veri setlerinin iki ve üç boyutta analiz edilmesinin karmaşıklığı nedeniyle. Bu prosedüre, kimyasal olarak boyanmış pankreasın immünohistokimyasal kesitini içeren temiz bir lamı floresan mikroskobun tutucusuna yerleştirerek başlayın. Stereo Investigator yazılımını açın ve "acquisition" (edinme) seçeneğine tıklayarak örneği görüntüleyin.

Ardından canlı görüntüleme yapın. Floresan yoğunluğunu gösteren video histogram penceresini kullanarak her bir kanal için pozlama seviyelerini belirleyin. Bu örnekte kanal iki DAP, kanal üç GFP, kanal dört RFP, kanal beş sci five ve kanal altı SCI seven için kullanılmıştır.

Kamera ayarları penceresini kullanarak, floresans yoğunluğu sönümlenene kadar pozlama seviyesini ayarlayın. Video histogramının sağ ucunda, görüntü mikroskop odaklama tekerleği ile netleştirilebilir. Sanal bir kesit oluşturmadan önce, referans noktası belirlemek için ekran üzerinde örneğin dışında bir noktaya tıklayarak örneğin çevresini belirleyin.

Ardından, kontur tamamlandığında örneğin dış hattı boyunca tıklayın. Kontur kapandıktan sonra başlangıç ve bitiş noktalarını birleştirmek için sağ tıklayıp "close contour" seçeneğini belirleyin, "acquisition" seçeneğini seçerek örnek için sanal bir kesit yakalayın ve ardından "acquire virtual slice" işlemine tıklayın. Sanal kesit penceresi seçenekleri açıldığında, "high speed acquire" seçeneğini belirleyin ve "manual" seçeneğini devre dışı bırakın.

Manuel seçeneğinin yanındaki kutucuğun işaretini kaldırarak odaklama yapın. Dosyayı kaydedin. Sağ tıklayıp odak sitesi listesine ekle seçeneğini seçerek prefo'yu kalibre edin.

Sanal kesit önizlemesinde rastgele birkaç bölgeye manuel olarak odaklanın. Birkaç bölgeye odaklanıldıktan sonra, sağ tıklayıp seçerek sanal kesiti başlatın. İlk örnek için sanal kesit tamamlandıktan sonra, bir sonraki kanala geçin ve pozlamayı buna göre ayarlayın. Gözelerle (eyelets) ilgili nicel analiz yapmak için bu prosedür her kanal için tekrarlanır; görüntüleri, önce yüklenen görüntüleri analiz için hazırlayan ve ardından hücresel kompozisyon gibi gözelerin özelliklerini nicelleştiren I-H-C-V-S adlı bir ImageJ makrosu kullanarak işleyin.

I-H-C-V-S makroları, yığını ilgili renk kanallarına ayırır. ImageJ'de her bir görüntü sekiz bitlik siyah beyaz bir maskeye dönüştürülür. Otomatik yoğunluk eşiği belirleme işleminin ardından, ayrı kanal görüntüleri aritmetik olarak toplanarak bir kompozit maske oluşturulur.

Ardından, Image J'nin kompozit görüntü üzerindeki yerleşik partikül analizi, bir beta hücresinden daha küçük olan partikülleri hariç tutarak ilgi alanlarını veya ROI'leri tanımlayacaktır. Image J kullanılarak yapılan ROI'lerin nicelendirmesi, hücre parametrelerini içeren bir hesap çizelgesi oluşturur.

Birleştirilmiş sonuçları bir Excel hesap tablosuna kaydedin. Her bir gözle (eyelet) için alan, çevre, dairesellik, Fer çapı ve gözle merkezi gibi verileri, görüntüde etiketlenen ilgili numaralarla birlikte saklayın. Bu parametrelerin hesaplamalı analizi, yazılı protokolde açıklanan şekilde gerçekleştirilebilir. Gözle dağılımı ve frekans analizi dahil olmak üzere bilgileri ortaya çıkarmak için, dizindeki tüm JP2 görüntülerini TIF dosyalarına dönüştüren bir betik çalıştırarak sanal dilimlerin 3D rekonstrüksiyonunu yapın; TIF, sanal dilimlerden üç boyutlu yığınların oluşturulması ve nicelendirilmesinde kullanılan formattır.

Burada, I MJ two two tiff adlı bir betik kullanılmıştır. Betiği, JP two görüntülerinin bulunduğu dizine kopyalayın. Konsola dot slash I am JP two two TIFF yazıp enter tuşuna basarak, betiği Linux kabuğu ile çalıştırın.

Yakalanan tüm görüntüler JPEG'den TIFF dosyalarına dönüştürüldüğünde, ImageJ'de analiz edilmeye hazır hale gelirler. ImageJ kullanarak, bu örnekte insan fetal pankreasından alınan ilk örneğe ait tüm görüntüleri açın ve "image", "color" ve ardından "merge channels" seçeneklerini belirleyerek bunları tek bir görüntü şeklinde birleştirin. Tüm örnekler tekil görüntüler olarak birleştirilene kadar bu işlemi her bir örnek için tekrarlayın. Poligon seçim aracını kullanarak istenmeyen bölgeleri seçip görüntüleri temizleyin.

Düzenle ve ardından doldur seçeneklerini belirleyerek bunları doldurun. Her bir görüntüyü RGB renkli görüntüye dönüştürün. Son olarak, görüntülerden bir yığın oluşturun; bu işlemden sonra görüntüler stack reg eklentisi ile daha fazla hizalanabilir.

Nihayetinde, kanalların birleştirilmesi ve görüntülerin kombinlenmesi, tüm pankreastaki tüm gözeciklerin 3D bir montajını oluşturur. Görüntü yığınlarını toplamak için, tüm montajlı pankreas gözeciklerini mikroskobun altına yerleştirin. Su daldırma objektif lensi kullanıyorsanız su uygulayın.

Slide book yazılımını açın, odak kontrol penceresindeyken kontrol artı shift artı E tuşlarına basarak yakalama ve odak kontrolüne erişin. Objektifi, eyelet boyutuna bağlı olarak 20 kat veya 40 kat olarak ayarlayın. Eyeletleri konumlandırmak için mikroskop okülerini kullanmak üzere bin ayarını iki kat olarak ve filtre setini kullanıcı bir olarak ayarlayın.

Odak kontrol penceresinde, emisyon seçimi %100Eyes olarak ayarlanmalı, nötr yoğunluk bir tık GFP ey şeklinde ayarlanmalı ve ardından örneği slide book içerisinde görselleştirmek için floor açılmalıdır; odak kontrol penceresine dönüp filtre seti fix olarak değiştirilmelidir. Ardından G-F-P-D-S'ye tıklayın. Joystick'i kullanarak gözlüğü kamera bir penceresinde mümkün olduğunca merkeze getirin.

Hücrelerin kolayca ayırt edilebildiği, halka merkezine yakın bir derinliğe odaklanın. Odak kontrol penceresinde zab'ı seçin. Özelliklerin net bir şekilde ayırt edilebildiği halkanın en üst derinliğine kaydırmak için dürbün kontrolünü kullanın ve set top'a tıklayın.

Kuşgözü kısmının altına kadar kaydırın ve set'e tıklayın. Alt tarafa tıklayıp ilerleyin. Yakalama penceresindeki referans noktasına dönmek için gelişmiş sekmesine, ardından kanal moduna alternatif seçeneğine tıklayın.

Pencerenin sağ tarafında bin faktörünü iki kat olarak ve yakalama türünü 3D olarak ayarlayın; üst ve alt pozisyonları kullan seçeneğine ve yakalamadan sonra merkez hacme dön seçeneğine tıklayın. Adım boyutunu üç olarak ayarlayın. Filtre seti kutusunun altında bulunan filtre setini canlı olarak ayarlayın.

DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U ve SCI beş DSU'yu seçin. Her biri için, pozlama ayarları (adjust exposure) altındaki en iyiyi bul (find best) seçeneğine tıklayın. Ardından, seçilen pozlamanın uygun olduğundan emin olmak için test seçeneğine tıklayın.

Görüntülemeye başlamak için başlat'a tıklayın. Görüntüleme tamamlandığında, seviyeleri gerektiği şekilde ayarlayın ve RFP için görüntülenen rengi beyaza çevirin. Slaydı kaydedin ve TIFF serisi dışa aktarma görünümüne gidin.

Slaydın adını sonuna bir tire ekleyerek yazın ve kaydedin. Çok sayıda bireysel TIF dosyası oluşturulacağından, her bir gözlecik görüntü yığınını ayrı bir klasörde tutmak faydalı olabilir. Görüntü yığınlarını eşlemek için stereo investigator yazılımını açın.

Görüntü ölçeklendirme menüsündeki görüntü yığınlarını açarak görüntüyü görselleştirin. İki kat bükülmeyi düzeltmek için görüntüler arasındaki mesafeyi üç mikron olarak ayarlayın. Slayt kitabında X ve Y ölçeklendirmesini geçersiz kıl seçeneğini belirleyin ve X ve Y ölçeklendirme kaynağı için belirtilen değeri kullanın.

Hem X hem de Y merkez değerleri için 0.65 girin, yakınlaştırma düğmesine tıklayarak görüntüye yakınlaşın ve ardından makro penceresinde ilgilenilen adacığın ortasında en az bir hücreyi işaretleyin. Uygun işaretleyici kullanıldığında beta hücreleri yeşil, alfa hücreleri kırmızı ve delta hücreleri beyaz görünecektir.

Örnek DPI ile boyanmışsa mavi görünecek olan çekirdeğin merkezindeki hücreleri işaretleyin; beta hücrelerini işaretlemek için Marker two'yu, alfa hücrelerini işaretlemek için Marker five'ı ve delta hücrelerini işaretlemek için marker six'ı kullanın. En az bir hücre işaretlendikten sonra, üst menüdeki simgeyi kullanarak ortogonal görünümü görüntüleyin, Z filtresini ve simetriği (symmetric) işaretleyin.

Aralık 15.00 olarak ayarlanmalıdır. 0.0 Z noktasından başlayarak, fare tekerleğini kullanarak gözlemler arasında ilerleyin ve her bir hücreyi uygun işaretleyici ile işaretleyin; her hücreyi derinliğinin merkezinden yalnızca bir kez işaretleyin. Her bir Z seviyesinin işaretlenmesi tamamlandığında, Z filtresi onay kutusu seçilmemiş hale getirilebilir.

Bu işlem, tüm Z seviyelerindeki tüm işaretleyicileri gösterecektir. Tüm hücreler işaretlendiğinde, dosyayı DAT dosyası olarak kaydedin. Ardından dosya menüsünden izleme dışa aktarma (export tracing) seçeneğine gidin.

İzlemeyi bir TXT dosyası olarak kaydedin. Son olarak, yeni gözlerle eşleştirme yapmaya çalışmadan önce çalışma alanını temizlemek için yeni veri dosyasına tıklayın. İmmünohistokimyasal olarak boyanmış bir pankreas örneğinden sanal kesitlerin hazırlanması, tüm pankreastaki alfa, beta ve delta endokrin hücrelerinin adacıklar olarak birlikte incelenmesine olanak tanır; insülin için immünohistokimyasal boyama yeşil, glukagon kırmızı, somatostatin beyaz ve dap mavi renkte görülebilir.

Görüntüler daha sonra otomatik eşikleme sonrası sekiz bitlik maskeye dönüştürüldü. Burada birleştirilmiş kompozit görüntü gösterilmektedir. Bununla birlikte, sanal kesit kullanılarak yapılan eyelet dağılımı, ayrı kanallarda bireysel analize de olanak tanır.

Burada, delta hücrelerini, beta hücrelerini ve alfa hücrelerini ortaya çıkarmak için her bir kanalın görünümleri gösterilmiştir. Her bir gözle yapılandırmanın numaralandırıldığı ve mavi ile vurgulandığı kompozit maske üzerinde partikül analizi gerçekleştirilmiştir. Kompozit maskelerin partikül analizi; tespit edilen her bir gözle için adacık alanı, çevresi, dairesellik ve çeşitli çaplar gibi parametreleri içeren ve kompozit maskedeki numaralandırılmış etiketlere karşılık gelen kimliklere (ID) sahip bir veri tablosu olarak çıktı verilmiştir.

Bu görüntülerin geniş ölçekli analizi, toplam eyelet sayısı ve boyut dağılım histogramlarının yanı sıra alfa, beta ve delta hücre alanlarının ayrıntılı karşılaştırmalarının üretilmesiyle sonuçlanır. Eyelet haritalama ile hücresel kompozisyon ve mimarinin matematiksel analizi, Stereo Investigator'a yüklenen insan eyeletlerinin 3D rekonstrüksiyonlu görüntü yığınından tek bir odak düzlemini ortaya çıkarabilir. Burada beta hücreleri yeşil, alfa hücreleri kırmızı, delta hücreleri beyaz ve çekirdekler mavidir.

Belirgin eyeletlerin yakalanmasını takiben, burada çeşitli deniz düzlemlerinde alfa, beta ve delta hücreleri işaretlenmiş olup, 10 mikron aralıklarla üç farklı odak düzlemi için floresan görüntüler ve bunlara karşılık gelen haritalama verileri gösterilmiştir. Alfa, beta ve delta hücreleri çeşitli düzlemlerde işaretlendikten sonra, eyelet 3D olarak görselleştirilebilir. Burada, eyelet haritalaması ile elde edilen koordinatlara dayalı olarak, çeyrek dilimli eyeletin 3D rekonstrüksiyonu gösterilmektedir.

Ayrıca, haritalanmış gözlerin otomatik matematiksel analizi, hücresel kompozisyonu ve mimariyi gösterebilir. Burada, tek bir hücre popülasyonundaki iki hücre arasındaki hücre-hücre mesafelerinin göreli frekansı gösterilmiştir. Ayrıca, iki farklı hücre popülasyonu arasındaki hücre-hücre mesafelerinin göreli frekansı da gösterilmektedir.

Ayrıca alfa'dan alfa'ya, beta'dan beta'ya ve delta'dan delta'ya hücrelerin hücreler arası mesafe dağılımlarının kümülatif olasılıkları da gösterilmiştir. İlgili KS mesafelerini elde etmek için bu olasılıklar üzerinde Kolmogorov-Smirnov veya KS testi uygulanabilir. Bu yöntem uzmanlaşıldığında, tüm bir doku kesitinin geniş ölçekli görüntülemesi ve analizi dört saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bir doku bloğunun 3D rekonstrüksiyonu 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Son olarak, doğru şekilde uygulandığında 3D görüntüleme ve manuel haritalama dört saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, kesitlerin yüksek kaliteli bir immünohistokimyasal boyama ile başlanması önemlidir.

Sonraki analizlerin doğruluğu tamamen ham verilere bağlı olacaktır. Ayrıca, bilgisayarlarınızın, geliştirme aşamasından sonraki bu tür geniş ölçekli analizleri işleyebilmek için en az sekiz gigabayt RAM'e sahip olduğundan emin olun. Bu teknik, sadece obezite ve diyabet alanındaki araştırmacıların değil, standart patolojik analizlerin kullanıldığı diğer birçok alandaki araştırmacıların da önünü açmıştır.

Özellikle örneklerin sınırlı olduğu durumlarda oldukça faydalı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, standart teknikler kullanarak sınırlı bir örneklem boyutu içerisinde yanlı olmayan temsilci verilerin nasıl toplanacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Pankreatik adacık dağılımı çalışmamızda gösterdiğimiz gibi, yalnızca belirli bir bölgenin seçilmesi genel resmi temsil etmeyebilir.