Keneler de RNA Girişim

Bu prosedürün genel amacı, kenelerde enjeksiyon yoluyla RNA interferans tekniğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle ilgili genin veya genlerin çift zincirli RNA'sının sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra RNA kenelere enjekte edilir ve ardından keneler 24 saat boyunca bir nem odasında tutulur.

Bu bekletme süresinin ardından, kenelerin son olarak koyun gibi bir hayvan üzerinde beslenmelerine izin verilir. Ağırlık, tüy dökümü ve ova konumu gibi beslenme parametreleri ile hedeflenen gen veya genlerin real-time R-T-P-C-R ile ekspresyonları belirlenir. Nihayetinde, kene biyolojik parametrelerinin değerlendirilmesi ve real-time R-T-P-C-R ile gen ekspresyonu analizi yoluyla, hedeflenen genlerin susturulmasının kene biyolojisi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Grubumuz, kene istilasının kontrolü ve patojenlerin insanlara ve hayvanlara bulaşmasını önlemeye yönelik yöntemler geliştirmek amacıyla, kene-patojen arayüzündeki moleküler olayları karakterize etmeye çalışarak keneler üzerinde çalışmaktadır. RNA interferans, kenelerin genetik manipülasyonu için mevcut olan tek yöntem olması nedeniyle bu araştırmalarda temel bir araç haline gelmiştir. Birçok kene geninin işlevi henüz bilinmemektedir.

RNA interferans, çiftleşme, üreme, beslenme, sindirim, tükürük bezi fonksiyonu ve kenelerin patojen iletimindeki vektör yetkinliği dahil olmak üzere kene biyolojisinin birçok yönünde kene genlerinin ve gen ekspresyonunun rolünü belirlememize olanak tanır. Prosedürü, laboratuvarımızdan kene RNA interferans ekibi olan Dr. Ed Lewin, lisansüstü öğrencisi Busby ve ben göstereceğiz. Çift zincirli RNA üretmek için öncelikle RNA'nın in vitro transkripsiyonu için T7 promotör dizileri içeren oligonükleotid primerleri sentezleyin.

Örneğin, derma center vari lesin için. Burada gösterilen D eight A a T 75 ve D eight DVT 73 oligonükleotid primerlerini kullanın. Her bir oligonükleotid primerinden 10 picomoles ve 1 ila 10 nanograms kene toplam RNA'sı kullanarak R-T-P-C-R ile hedef geni amplifiye edin.

Ardından, PCR ürününü saflaştırın. Daha sonra, çift zincirli RNA sentezlemek için sekiz µL veya yaklaşık 100 ng kullanın. Keneleri enjeksiyona hazırlamak için öncelikle keneleri şu çözelti serisiyle yıkayın: musluk suyu, %3 hidrojen peroksit, iki kez distile su, %70 etanol ve son olarak iki kez distile su ile yıkama yapın.

Her bir yıkama işlemini 50 mililitrelik tek kullanımlık bir santrifüj tüpünde çalkalayarak gerçekleştirin. Ardından çözeltiyi ince gözenekli bir tel süzgeç aracılığıyla süzün. Keneleri kağıt havlu üzerinde kurutun, daha sonra deneye bağlı olarak keneleri 20 ila 50'li gruplar halinde paylaştırın.

Her grubu, sıkı kapanan kapaklı 1,25 onsluk plastik bir kaba yerleştirin ve her kabı deney grubuyla etiketleyin. Ardından, enjeksiyon işlemini gerçekleştirecek üç kişiden oluşan bir RNAi ekibi kurun. İlk kişi, her bir keneyi, üçe altı inçlik kırmızı dental mum tabakasına sabitlenmiş çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirir.

İkinci kişi kenelere enjeksiyon yapar ve üçüncü kişi enjeksiyondan sonra keneleri izler; keneleri aktive etmek için üzerlerine karbondioksit solur, canlı keneleri sayarak deneysel grup numarasıyla etiketlenmiş kaplara aktarır. Tüm ekip üyeleri tek kullanımlık eldiven giymelidir. Kene enjeksiyon sürecine başlamak için, dumont ince pens kullanarak bir kene yakalayın ve onu kırmızı dental mum tabakasına yapıştırılmış çift taraflı yapışkan bandın üzerine ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Keneleri beşli gruplar halinde yakın konumlandırın. Beş kenenin tamamının ağız kısımlarının üzerine küçük bir maskeleme bandı şeridi yerleştirin.

Kene enjekte eden kişinin enjeksiyon sürecini gözlemleyebilmesi için, keneleri daha fazla sabitledikten sonra gövdelerinin çoğunu açıkta bırakın. Keneye enjeksiyon yapmak için, 29 gauge yarım inçlik bir iğne takılmış tek kullanımlık bir insülin şırıngası kullanarak ekzoskeletin ventral yüzeyinin sağ alt kadranında bir delik açın. Ardından, özel yapım bir Hamilton şırıngası ve 45 derecelik eğimli uca sahip 33 gauge bir inçlik bir iğne kullanarak kenelere derhal 0.2 ila 0.5 µL çift zincirli RNA çözeltisi enjekte edin; çift zincirli RNA'nın yerleşmesini ve kalmasını sağlamak için iğneyi kene boşluğuna iyice yerleştirin.

Enjeksiyondan sonra sıvı salınsa bile, iğnenin derin yerleştirilmesi, gen susturmaya neden olacak yeterli miktarda çift sarmallı RNA'nın kene boşluğuna depolanmasını sağlayacaktır; ancak aşırı enjeksiyon yapılmamasına dikkat edilmelidir. Aşırı enjeksiyon hemolenf kaybına ve kenenin ölümüne yol açacaktır. Kenelere enjeksiyon yapıldıktan hemen sonra, keneleri ince pensle çift taraflı yapışkan banttan alın ve plastik bir toparlanma kabına yerleştirin.

Keneler enjeksiyondan sonra kısa bir süre hareketsiz kalacak, ancak kısa süre içinde kabın içinde sürünmeye başlayacaklardır. Keneleri üzerlerine karbondioksit soluyarak aktive edin. Keneler sürünmeye ve aktif hale geldiğinde, enjeksiyon yarası hızla iyileşecek ve büyük olasılıkla hayatta kalacaklardır.

Her deneysel gruptaki keneleri sayın ve her grubu, sıkıca kapanan kapaklı, etiketlenmiş plastik bir kaba yerleştirin. Bir sonraki deneysel grubu enjekte etmeden önce, mevcut grupta ölen kenelerin yerine yenilerini koyun. Bir sonraki deneysel grubu enjekte etmeden önce, Hamilton şırıngasını taze %3 hidrojen peroksit ile doldurup boşaltarak temizleyin.

Steril su ile 15 kez yıkama işlemi uygulayın. Hamilton şırıngasının pistonunu bükmemeye dikkat edin; aksi takdirde piston pürüzsüzce hareket etmeyecek ve kene enjeksiyonu için gereken hassas dokunuşa yanıt vermeyecektir. Enjeksiyondan sonra keneleri, yüksek nemi koruyan ve onları bir gün boyunca muhafaza eden, su ve potasyum sülfat dolu bir kap içeren bir hazneye yerleştirin.

Ardından, tek tek keneleri bir koyuna yapıştırılmış kene besleme hücrelerine yerleştirin ve enjekte edilmemiş erkek veya dişi kenelerle (enjeksiyon yapılmayan cinsiyet hangisiyse) eşit sayıda beslenmelerine izin verin. Beslenme işlemi yaklaşık 10 gün sürdüğünde veya kontrol grubu dişileri konaktan ayrıldığında, dişi keneleri besleme hücresinden toplayın ve yumurtlama işlemi tamamlanana kadar her kene grubunu nem odasında inkübe edin. Beslenme sonrası kene fenotipini değerlendirmek için, her gruptaki tüm keneler tarafından üretilen yumurta kütlesini tartarak grup bazlı yumurtlama durumunu değerlendirin.

Hayatta kalan kene sayısını belirleyin ve kene ağırlığının yanı sıra ova konumunu ve yumurtaların fertilitesini hesaplayın. Hedeflenen gene ve çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, R-T-P-C-R ile gen susturulmasını doğrulamak için diğer analizler gerçekleştirilebilir. Beslemeden sonra, kontrol enjeksiyonu yapılan ve çift zincirli RNA enjeksiyonu yapılan gruplardaki tekil kenelerden tükürük bezlerini ve bağırsakları disseke edin ve ardından bireysel doku örneklerinden toplam RNA ekstre edin.

Hedef gen transkriptlerini gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile tekil dokularda analiz edin ve RNA seviyelerini kene 16 s ribozomal RNA'ya göre normalize edin. Gen norm yöntemini kullanarak, yalnızca tek bir amplikon oluştuğundan ve amplikonların her örnek için tutarlı bir şekilde aynı sıcaklık aralığında denatüre olduğundan emin olmak amacıyla reaksiyon sonunda dissosiyasyon eğrileri çalıştırın; kontrol enjekte edilen ve çift zincirli RNA enjekte edilen keneler arasındaki mRNA seviyeleri için normalize edilmiş CT değerlerini Student's T-testi kullanarak karşılaştırın.

Burada açıklanan protokol, laboratuvarımızda birçok farklı ekzotik kene türünde RNAi için kullanılmıştır. Kenelere enjekte edilen çift sarmallı RNA miktarı, kenenin boyutuna göre değişir. Daha büyük kene türleri, daha yüksek hacimleri tolere edebilir.

Referanslar, protokolün beraberindeki yazılı bölümde bulunabilir. Protokol doğru şekilde uygulandığında, 24 saat sonra enjeksiyon işleminden kaynaklı mortalite %5'ten az olmalıdır. Kenelerde gen susturulması sonrası tipik bir fenotip burada gösterilmiştir; bu örnekte, kene koruyucu antijenlerin taranması için kullanılan çift zincirli RNA havuzları bir grup keneye enjekte edilmiştir.

Işık mikroskobu ile incelenen kenelerde, kene dokularında hücresel dejenerasyon gözlemlenebilir. Fenotipik değişikliklere fonksiyon kaybı da eşlik edebilir. Örneğin, SUBIN'in RNAI'si, dişi kenelerle başarılı bir şekilde çiftleşemeyen steril erkeklerin ortaya çıkmasıyla sonuçlanır. RNA interferansı ve keneler.

Real-time R-T-P-C-R, ışık, elektron veya konfokal mikroskobi, genomik veya proteomik dahil olmak üzere, gen susturmanın gen ve protein ekspresyonu ile kene biyolojisi üzerindeki etkisini belirlemek için diğer yöntemler kullanılabilir. RNA interferans ayrıca kene hücre kültürlerinde de uygulanabilir ve kene hücre-patojen etkileşimlerinin incelenmesi için in vitro bir yöntem sağlar.