Güve Koku Sistemi Elektrofizyolojik Ölçümler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, böcek sinir sisteminden koku tepkilerinin kaydedilmesinin kolaylığını göstermektir. Bu işlem, canlı bir güve sabitlenerek ve koku maddesinin tetiklediği tepkileri kaydetmek için antene veya tek bir nörona elektrotlar bağlanarak gerçekleştirilir. İlk adım olarak, toprak hattı olarak göze salinle dolu bir cam elektrot yerleştirilir; ikinci adım olarak, sabitlenmiş güvelerden herhangi birine, koku reseptör nöronundan tek bir birim tepkilerini kaydetmek için antenogram şeklinde elektriksel tepkilerin kaydedilmesini sağlayan salinle dolu bir cam elektrot yerleştirilir.

Kayıt elektrodu, bir antenin tabanına yerleştirilir. Ardından, anten sinyali yükseltilir ve sinyalleri kaydetmek ve saklamak amacıyla bir analog dijital dönüştürücüye aktarılır. Kaydedilen elektriksel sinyale dayalı olarak, bir EAG sinyali veya bir spike formunda, doza bağımlı ve koku maddesiyle tetiklenen yanıtlar elde edilir.

Naval portakal güvesinin sabitlenmiş canlı örneğinden Enterogram kaydetmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu tekniğin temel avantajı, hazırlık sürecinin uzun süre dayanması, aynı güvenin birden fazla yanıtı kaydetmek için defalarca kullanılabilmesi ve aynı güvenin antenindeki tek bir sensörden tek bir birim yanıtlarını kaydetmek için de kullanılabilmesidir. Kaliforniya'da önemli bir tarımsal konumu olduğu için naval portakal güvesine odaklanıyoruz.

Bununla birlikte, bu yöntem sadece temel koku fonksiyonu sorularını yanıtlamak için değil, aynı zamanda yeni çekicilerin geliştirilmesi için de diğer epitoter böceklerde kullanılabilir. Güve koku sistemi üzerine yapılan bu çalışmada, naval portakal kurdu *Ullo Ella* kullanılmıştır.

Böcek kolonisi, çevresel odalarda yaklaşık 28 °C sıcaklıkta, yaklaşık %75 bağıl nemde ve 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık şeklinde bir fotoperiyotta buğday kepeği diyeti ile beslenmektedir. Plastik bir kutuya 10 kata kadar suya doyurulmuş kağıt havlu yerleştirerek yeni çıkan güveler için kaplar oluşturun. Çıkan güveleri günlük olarak toplayıp cinsiyetlerini belirleyin ve ardından plastik kutuya aktarın. Elektrofizyolojik kayıt hazırlıkları için hava sirkülasyonuna izin verecek şekilde kutuyu delikli bir kapakla kapatın.

İlk olarak, 200 µL'lik bir pipet ucunu, uç çapı yaklaşık iki milimetre olacak şekilde keserek güve için bir tutucu hazırlayın. EAG veya SSR için, çıkıştan sonraki ikinci ila dördüncü gününde olan bir güve seçin. Güveyi, nemlendirilmiş bir doku kağıdı parçası kullanarak pipetin uç kısmının karşı tarafındaki ucundan içeri yerleştirin ve güveyi nazikçe pipet ucuna doğru itin.

Antenler ve başın bir kısmı uçtan dışarı çıkana kadar güveyi itmeye devam edin; başın küçük bir kısmını ve iki anteni açıkta bırakacak şekilde başı kurumayan bir kil ile kaplayarak açıkta kalan başı sabitleyin. Güve örneğini, uç çapları bir mikrondan küçük cam elektrotlar kullanarak, iki elektrot tutucu arasında bulunan elektrogram mikro manipülatör platformuna yerleştirin. Elektrotları centum limb ringer ile doldurun.

Mikroskop altında, gözün açık olan bölgesini bir elektrotla delin. Bu, referans elektrot olarak hizmet eder. Bir sonraki adım, kayıt elektrotlarını antenlere yerleştirmektir.

Erkek deniz turuncu kurt güvesinin anteni çok segmentlidir ve her segment çok sayıda kıl benzeri yapı ile bezelidir. Illa, ekteki görüntü antenlerden kayıt alınmasını kolaylaştırmak için illa detaylarını gösteren bir taramalı elektron mikrografıdır. Distal taraftaki bir veya iki anten segmentini kesin.

Ardından, her iki anteni de kayıt elektroduna yerleştirin. Alternatif olarak, tekli sens kayıtları için kayıt elektrodunu bir sensin tabanına yerleştirin. Senslerden gelen aksiyon potansiyelleri, yüksek empedanslı bir ön amplifikatör ile yükseltilir ve autos spike yazılımı ile çevrimdışı analiz edilmek üzere USB akıllı dijital analog dönüştürücüye aktarılır.

Bir sonraki adım, naval portakal kurdundan elde edilen dişi feromon karışımının ana bileşeni olan ZZ 1113 HEXA deca Now kullanılarak kimyasal stimülüsü hazırlamaktır; kimyasal maddeyi, DIC dilüsyonları oluşturmak için heksan ile seyreltin. Bir Watman filtre kağıdı üzerine 10 µL stimülüs çözeltisi yükleyin. Çözücüyü 10 saniye boyunca hafifçe sallayarak buharlaştırın.

Bir çeker ocak altında, şeridi beş mililitrelik bir polipropilen şırıngaya yerleştirin; hazırlık aşamasında kontrol olarak sadece heksan ve boş bir şırınga kullanılır. EAG veya SSR, stimulus kontrolörü tarafından saniyede 20 mililitre hızla iletilen nemlendirilmiş bir hava akımı içinde tutulur. Kimyasal stimulus içeren şırıngayı hava akımı kontrolörüne bağlayın.

İki saniyelik bazal elektriksel sinyalleri kaydedin. Ardından, Airstream'e 500 milisaniye boyunca saniyede dört mililitrelik bir stimülasyon darbesi ekleyin. Elektriksel sinyalleri sekiz saniye daha kaydetmeye devam edin.

Stimülasyonlar arasında en az bir dakika bekleyin. Bu şekil, sabitlenmiş bir erkek güvenin antenlerinden gelen güçlü, doza bağımlı bir yanıtı göstermektedir. Dişi feromon bileşeni CZ 1113 hexaco ile stimüle edilmiştir.

Heksana verilen yanıt. Araç kontrolü sırasıyla mavi çizgi ile gösterilmiştir. Feromonun daha yüksek dozları, sırasıyla daha büyük elektrogram kayıtları oluşturur.

Bu şekil, dişi feromon bileşeninden gelen uyarana yanıt olarak bir trikandiumdan alınan hücre dışı tek ünite kayıtlarını göstermektedir. Bu kayıtlar, doza bağlı eksitatör bir yanıt sergilemektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem birkaç saat içinde tamamlanabilir.

Bu yöntem kullanılırken kontaminasyondan kaçınmaya ve kimyasalları mümkün olduğunca saf olarak kullanmaya özen gösterin.