Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir hedef DNA dizisi için rastgele bir mutant kütüphanesi oluşturmak ve yarı kantitatif fonksiyonel seleksiyon kullanarak mutantları hızla belirleyip karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hedef diziyi içeren tek bir replikasyon orijinine sahip bir plazmidin mutator suşuna transforme edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücreler plakalanıp gece boyunca inkübe edildikten sonra hasat edilir ve mutant kütüphanesini elde etmek için hedef plazmid izole edilir; ardından mutant kütüphanesi, protokolün ikinci bölümünde mutasyonları karakterize etmek amacıyla bir okuma suşuna transforme edilir. Bir gradyan büyüme plağı hazırlanır ve okuma suşunun bakteri kültürleri, yumuşak agar içeren ayrı bir Petri kabına yüklenir.

Prosedürün son adımı, bu bakteri kültürlerini damgalama yoluyla gradyene aktarmaktır. Nihayetinde, belirli bir hedef dizinin fenotip profilindeki değişikliklerin, ilaç gradyeni üzerindeki büyüme farkları aracılığıyla gösterildiği sonuçlar elde edilebilir. Bu video, e coli'de proteinlerin yönlendirilmiş evrimi için bir yöntemi sunmaktadır.

Bu süreç, rastgele besin kütüphanelerinin oluşturulmasındaki doğal evrimi ve ardından bu çeşitliliği kısıtlayan bir seçilimi taklit eder. Böylece, endüstriyel veya biyomedikal amaçlar için yeni biyokimyasal aktiviteler üretme yeteneğimizi artırır. Bu prosedür iki bileşenden oluşmaktadır: rastgele mutant kütüphanesinin oluşturulması ve fonksiyon kazanımı mutasyonlarını elde etmek için yapılan fonksiyonel seçim. Bu prosedürü laboratuvarımdan teknisyen Jennifer Allen uygulamayı gösterecektir.

Bu protokole başlamadan önce, yazılı protokolde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış olan, DNA polimeraz birin düşük sadakatli bir varyantını veya düşük sadakatli pol I'i eksprese eden elektrokompetan JS 200 hücreleri hazır bulundurulmalıdır; bu hücreler, 37 °C'de düşük sadakatli pol I aktivitesinin baskın hale gelmesini sağlayan sıcaklığa duyarlı bir pol I aleli içerir. Hedef dizinin replikasyon orijinine bitişik olarak klonlandığı, coli 1 replikasyon orijini içeren bir hedef plazmit oluşturun; düşük sadakatli pol I, coli 1 plazmit replikasyonunu başlatır. Böylece mutajenezi başlatmak için mutasyonlar eklenmiş olur.

2 mm'lik bir boşlukta 40 µL elektrokompetan hücre ile 30 ila 250 ng arasında hedef plazmit DNA'yı birleştirin. Karışımı elektroporatörde 1800 V'ta tek bir pulse ile elektropore edin. Her örnek için tekdüze iletim koşullarını sağlamak amacıyla zaman sabitini (TC) kontrol edin.

İdeal olarak TC beş ila altı milisaniyedir. Hücre DNA karışımının, 37 °C'de 250 RPM hızında çalkalanarak bir mililitre LB besiyerinde 40 dakika boyunca toparlanmasına izin verin. Her iki plazmidi de seçmek için uygun antibiyotikler içeren, 37 °C'ye önceden ısıtılmış 100 milimetrelik bir LV agro Petri kabı temin edin; toparlanan hücreleri, bu örnekte gösterildiği gibi, belirgin ancak sayılamayacak kadar çok koloni olarak tanımlanan çimlenmeye yakın bir konsantrasyon elde etmek için uygun bir dilüsyonda ekimleyin.

Gece boyu inkübasyonun ardından, Petri kaplarındaki bakteri kolonilerini LB besiyeri ile hasat edin. Hasat edilen hücrelerden plazmid DNA'yı izole edin; elde edilen plazmid DNA, rastgele mutant kütüphanesini oluşturur.

Hedef plazmidi ve pol plazmidi lineerleştiren bir restriksiyon enzimi ile plazmid kütüphanesini keserek bir restriksiyon sindirimi gerçekleştirin. İzole edilen plazmid DNA'sının kalitesini ve miktarını onaylamak için analitik bir agaroz jel elektroforezi yapın. Plazmidler doğrulandıktan sonra, kütüphanenin bir mikrogramını pol plazmidi lineerleştiren ancak hedef plazmidi kesmeyen bir restriksiyon enzimi ile sindirin.

Restriksiyon sindirimi tamamlandıktan sonra, kütüphaneyi bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin. Son olarak, mutasyonları karakterize etmek için temiz kütüphaneyi bir okuma suşuna transforme edin. Gradyan hazırlığına başlamak için, kare petri kabının tabanının bir kenarı boyunca eşit aralıklarla 10 şerit işaretleyin.

Çanağı, alt kısımdaki işaretli kenar yedi milimetre yükseltecek şekilde bir eğime yerleştirin. Uygun konsantrasyondaki seçici ajanla iyice karıştırılmış 25 mililitre ılık lb agarı eğimli çanağa dökün. Bu, gradyanın alt tabakasıdır.

LB agarın petri kabını, kabın yükseltilmiş işaretli ucunda yaklaşık bir milimetre, alçaltılmış kısmında ise yaklaşık sekiz milimetre LB agar olacak şekilde kapladığından emin olun. Havalandırma için plakayı KU kapakla kapatın ve agarın 10 ila 15 dakika boyunca donmasını bekleyin. LB agarın alt tabakası sertleştikten sonra kabı düz bir yüzeye taşıyın.

Ardından, ilk agar yüzeyini kaplamak için, seçici ajan içermeyen 25 mililitre sıcak lb agar dökün ve alt katmanın tamamının kaplandığından emin olun. Havalandırma için plakayı kapakla kapatın ve ardından bakterilerin damga transferini gerçekleştirmek için agarın 10 ila 15 dakika boyunca donmasını bekleyin. İlk olarak, okuma suşunun bakteri kültürlerini elde edin ve bunları 600 nanometrede 1,0'dan düşük bir optik yoğunluğa sahip olacak şekilde, özdeş hücre yoğunluklerine ulaşana kadar seyreltin.

Ardından, 42 °C'ye dengelenmiş iki mililitre sıvı yumuşak agarı 100 mm'lik yuvarlak bir Petri kabının tabanına aktarın, 40 µL bakteri kültürünü yumuşak agarın içine pipetleyin ve ardından plakayı sallayarak karıştırın. Cam mikroskop lamının uzun kenarını yumuşak agar karışımıyla kaplayın. Daha sonra, lamın kaplı kenarını gradyan kabındaki alt işaretle hizalayın.

Lamı agar yüzeyine dokundurun. Yumuşak agardan bir şeridin gradyan yüzeyine aktarılması için hafif bir dokunuş yeterlidir. Daha sonra lam, temizlenmek ve yeniden kullanılmak üzere kenara alınır.

Bu işlemi tekrarlayın. Kalan numuneler ve deneysel kontroller her gradyan plağına dahil edilmelidir. Eğer birden fazla gradyan yürütülüyorsa, gradyan plağını ters çevrilmiş şekilde gece boyunca 37 °C'de inkübe edin; inkübasyon süreleri ve sıcaklıkları farklı okuma bakteri suşları için farklılık gösterebilir, ancak gece boyunca 37 °C'de tutulması genellikle görünür büyüme için yeterlidir.

Son olarak, hücre büyümesini yazılı protokolde açıklandığı şekilde görüntüleyin ve analiz edin. Burada, ya mutasyona uğramamış P-G-F-U-V ya da dört tur mutajenezden geçirilmiş bir PG FPUV mutant kütüphanesi ile transforme edilmiş bir okuma suşunun görüntüleri yer almaktadır. Koyu veya soluk koloniler, GFP'yi inaktive eden mutasyonlar içeren plazmidleri göstermektedir.

Bu şekil, hedef plazmidin nötral dizisi boyunca her 100 baz çiftlik aralıkta meydana gelen mutasyonların frekansını göstermektedir. Mutasyonların plazmid dizisinin tamamında meydana geldiğine, ancak replikasyon orijinine en yakın bölgede en yüksek frekansta olduğuna dikkat ediniz. Burada, mutantların büyümesi bir ilaç gradyanına karşı gösterilmiştir.

Gradyanın üst kısmına doğru büyüme mesafesi, mutantlar arasındaki farklı ilaç direnç profilini göstermektedir. Bu örnekte, insan oksidatif demetilaz ABH two plazmit kütüphaneleri, ilaç seçilim gradyanları kullanılarak metil metan sülfonata karşı artmış direnç gösteren mutantlar için taranmıştır. Mutajenez protokolünün iki ve dört iterasyonunu temsil eden bu kütüphaneler, ebeveyn yabanıl tip ve boş vektör ile karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir.

Beyaz çizgi, tekil mutant kolonilerin izole edildiği eşik değerini belirtmektedir. Daha ileri fenotipik analizler için, daha önce düşük sadakatli P one mutajenezi ve astri ve m seçimi kullanılarak tanımlanan beta-laktamaz mutantları R 1 64 H ve E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, 0.4 µg/mL ve 4 µg/mL Cefotaxime gradyanı üzerinde gösterilmiştir. Cefotaxime'e karşı koruma, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz aktivitesine işaret etmektedir.

Yabani tip beta-laktamaz enziminin, boş vektör eksprese eden hücrelere kıyasla herhangi bir koruma sağlamadığını unutmayın. Bu nedenle, bu mutantlar bir adaptasyonu veya yeni bir biyokimyasal aktivitenin evrimini temsil etmektedir. Burada, bu yeni biyokimyasal aktivitelerin oluşturulması için mutajenez ve fonksiyonel seçilimin güçlü bir kombinasyonunu sunduk.

Fonksiyonel seçim, ya ilaç seçimi ya da genetik komplementasyon yoluyla elde edilebilir ve geniş bir genetik çeşitlilik oluşturma yeteneğimizden yararlanır. Mevcut protein aktivitelerini optimize etmek veya bölgeye özgü mutajenez yapmak için patojenezin belirli bir sekansla sınırlandırılması gerekebilir. Bunlar klonlama yoluyla kolayca gerçekleştirilebilir.

Ek olarak, imza saldırıları veya mutasyonel izler elde etmek amacıyla mutajenez, fonksiyonel seleksiyondan ayrıştırılabilir.