Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Diş yüzeylerinde oluşan biyofilmler oldukça karmaşık ve yapılandırılmıştır. Mikrobiyal topluluklar, sürekli çevresel zorluklara maruz kalan bir hücre dışı matrise hapsolmuş durumdadır. Buradaki genel amaç, oral biyofilmlerin karmaşık doğasını göz önünde bulundurarak, yeni bir floresan görüntüleme tekniğini veri işleme ve analiz için özel olarak hazırlanmış bir yazılımla birleştirerek, yapısal ve moleküler çalışmaları kolaylaştırmak için tasarlanmış bir analitik araç setinin iki spesifik bileşenini göstermektir.

Bu işlem, öncelikle EPS ve bakterilerin eş zamanlı görselleştirmesi için yeni bir konfokal görüntüleme yaklaşımı da dahil olmak üzere, biyofilm, transkriptom ve yapı analizi için spesifik assay'lerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, biyolojik testlerden ham verilerin toplanmasıdır. Üçüncü adım ise, kolokalizasyon analizi için yeni geliştirilen duo stat da dahil olmak üzere, ham verilerin spesifik yazılımlar kullanılarak işlenmesidir.

Son adım, microarray veri madenciliği ve organizasyon yazılımı microarray, data visualizer veya MDV'nin kullanımı da dahil olmak üzere işlem verilerini analiz etmektir. Nihayetinde, benzersiz şekilde entegre edilmiş analitik araç setimiz kullanılarak, oral patojenlerin kompleks diyete ve konakçı mikrobiyal etkileşimlerine yanıt olarak transkriptomlarını ve biyofilmlerin mimarisini nasıl değiştirdiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir; bu da daha kapsamlı bir biyofilm analizi ve veri yorumlaması sağlar. Merhaba, ismim Michelle Kuh, Rochester Tıp Merkezi'ndeki Oral Biyoloji Merkezi'nde doçentim.

Bugün, biyofilm analizi için analitik bir araç kutusu sunuyoruz. Bu araç kutusu; biyofilm hücrelerinin nasıl yapılandığı, hücre dışı matris ile nasıl düzenlendiği ve karmaşık çevresel zorluklara transkriptomik düzeyde nasıl yanıt verdikleri gibi biyofilm araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Benim adım Jean, Dr. Ks'nin laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım.

Bugün size araç setimizin görüntüleme kısmını göstereceğim. Merhaba, ben Aise Klein. Dr.Ks laboratuvarında araştırma görevlisi profesörüm.

Bugün, mikrodizisi veri analizi için kullanılan MDV yazılımını sunacağım. Bu prosedürde, üzerinde biyofilmlerin büyütüldüğü diş yüzeyi vekilleri olarak tükürük kaplı hidroksiapatit diskler kullanılmaktadır. İlk olarak, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna S. mutans inoküle edilmiş 2,8 ml kültür ortamı ekleyin; plakayı ışıktan koruyarak her kuyucuğa son konsantrasyonu 1 µM olacak şekilde dekstrin konjuge LOR 6 47 boyası ekleyin ve boyayı kültür ortamıyla karıştırmak için pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekin.

Ardından, steril pensler kullanarak steril tükürük kaplı hidroksiapatit diskleri, fazla tükürüğü veya bağlanmamış tükürük bileşenlerini uzaklaştırmak için steril AB tamponunda iki kez yıkayın. Daha sonra diskleri, her bir diskin tamamen daldığından emin olarak, boya takviyeli kültür ortamına dikey olarak yerleştirin. Plağı alüminyum folyo ile kapatın ve biyofilmlerin oluşması ve konjuge dokunun bakteriyel hücreler tarafından üretilen ekzopolisakkaritlere dahil olması için %5 karbon dioksit inkübatöründe 37 °C'de 20 saat inkübe edin.

Bakteriyel hücreleri etiketlemek için öncelikle, her kuyucuğa 2,8 mililitre steril milli Q su ekleyerek 24 kuyucuklu bir plaka hazırlayın. Her kuyucuğa, nihai konsantrasyonu bir mikromolar olacak şekilde 1,5 mikrolitre cyto nine boyası ekleyin ve plakayı ışıktan koruyun. Biyofilm oluştuktan sonra, diskleri içeren plakayı inkübasyon ortamından çıkarın.

Her bir diski %0.89 sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın. Ardından bunları, cyto nine boyası içeren yeni plakaya aktarın. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Hücreler boyandıktan sonra, biyofilmleri daha önce olduğu gibi daldırıp sodyum klorür ile yıkayın. Ardından bir pens yardımıyla, biyofilmleri telden sodyum klorür içeren bir Petri kabına aktarın. Petri kabını alüminyum folyo ile sarın.

Biyofilmler artık bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak konfokal mikroskopi ile görselleştirilmeye hazırdır. Her biyofilmi rastgele seçilmiş beş ila 10 konumdan tarayın ve her konumda Z serileri oluşturun. 3D rekonstrüksiyonlara izin vermek için konfokal görüntüleri açın ve bir ayna yazılımı kullanarak bunları işleyin.

Amira programı kullanılarak oluşturulan konfokal görüntülerin bu üç boyutlu renderı, gösterilen prosedür kullanılarak apatitik yüzey üzerinde oluşturulmuş bir S mutant biyofilmini göstermektedir. Bakteriyel hücreler ve mikro koloniler yeşil renkte görünür durumdadır ve ekzopolisakkaritler içeren biyofilm matrisine gömülüdür. Kırmızı renkte, seçili bir alanın yakın çekim görünümü oluşturulabilir; bu görünüm, mikro ölçekteki spesifik bakteri EPS yapısal ilişkisini örneklendirmektedir.

Bakteriler ve ekzopolisakkaritler gibi ayrı biyofilm bileşenlerinin kolokalizasyon miktarını belirlemek için duos stat programını kullanın. İlk olarak, MATLAB versiyon 5.1'de yeni geliştirilen duo stat'in yolunu ayarlayın ve iki biyofilm bileşeninin Z serisi görüntülerini içeren görüntü klasörlerini açın. Ardından, korele edilecek ve analiz edilecek iki kanalı seçin.

İki görüntü yığını, tüm boyutlarda aynı piksel boyutlarına ve her yığında aynı sayıda görüntüye sahip olmalıdır. Her kanal için eşik değerlerini belirleyin, yazılım arayüzündeki talimatları izleyin ve analiz için verileri veri işleme dosyasına girin. Bu şekil, duo stack'in bakteriler ve DBS arasındaki mekansal ilişkiyi nasıl nicel olarak yorumladığını göstermektedir.

Biyofilm içerisinde Duo, burada bakteriler için yeşil çizgi ve EPS için kırmızı çizgi ile görüldüğü üzere, disk yüzeyinden sıvı fazına kadar bakterilerin ve DPS'nin dikey dağılımını hesaplar. Ayrıca, biyofilm kalınlığı boyunca bakterilerin ve DPS'nin kolokalizasyonunu hesaplar. Sarı çizgi ile gösterildiği gibi, veriler biyofilm derinliği boyunca bakterilerden daha yüksek EPS oranları sergilemektedir ve özellikle orta tabakalardan yukarıya doğru bakteriyel hücrelerin çoğu EPS ile ilişkilidir; 3D modelleme ile Duo stat, biyofilmlerdeki bakterilerin ve DPS'nin yapısal organizasyonunun ve etkileşiminin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Biyofilmlerden yüksek kaliteli RNA elde edilmesini sağlamak için, RNA ekstraksiyonunun Curian KU tarafından 2007 yılında yayınlanan makalede açıklanan biyofilm spesifik protokole göre gerçekleştirilmesini öneririz. Dergide, cDNA mikroarray hazırlama ve kantitatif gerçek zamanlı PCR analizleri için analitik biyokimya standart protokolleri kullanılmıştır. Mikroarray deneyleri tarafından üretilen geniş veri setlerinin analizini kolaylaştırmak amacıyla, www.oralgen.anl.gov adresinde çevrim içi olarak sunulan, mikroarray veri görselleştirici veya MDV adlı bir veri madenciliği ve organizasyon yazılımı tasarladık.

Verileri MDV'ye göndermeden önce, sınıf karşılaştırması için 0.001 kesme P değeri kullanarak, çevrimiçi olarak erişilebilen BRB array tool yazılımı ile rastgele varyans modelli eşleştirilmiş T-testi gibi istatistiksel analizler gerçekleştirin. Bu örnekte, üç farklı şeker konsantrasyonu ve dört zaman noktasında büyütülen s mutton biyofilmlerinin analizi yapılmıştır. Üç BRB dosyası oluşturularak şu eşleştirilmiş karşılaştırmalar gerçekleştirilmiştir: durum A %0.5 sukroz artı %1 nişasta ile %1 sukroz karşılaştırması, durum B %0.5 sukroz artı %1 nişasta ile %0.5 sukroz karşılaştırması ve durum C %0.5 sukroz ile %1 sukroz karşılaştırması.

Bu panel, BRB array tool kullanılarak standart sınıf karşılaştırmasıyla değerlendirilen her koşul ve zaman noktasında diferansiyel olarak ifade edildiği tespit edilen gen sayısını temsil eder; bu işlem, BRB ham verileri olarak adlandırılan çok sayıda genle sonuçlanır. MDV gösterimi için, Excel kullanarak 30 saatlik zaman noktasına odaklanacağız. BRB ham verilerini MDV sekme sınırlı metin dosyalarına dönüştürün.

Gen lokusu sekme numarasıyla birlikte gelen tüm harfleri kaldırdığınızdan emin olun; örneğin SMU nokta 1432 C ismindeki C harfini silin, MDV'yi açın. Dosya menüsünü açın ve açıklama kaynağını seç seçeneğini belirleyin. Bir iletişim kutusu göründüğünde düz dosya seçeneğini seçin.

Gen ontolojisi numarası yol fonksiyonel sınıflandırma verileri ve gen adı için açıklamalar içeren dosyaları seçmek için göz at düğmelerini kullanın. Dosya menüsüne gidin ve MDV formatına dönüştürülmüş dosyaların her birini içe aktarın. Her bir dosya bir deneysel koşulu temsil eder.

A, B ve C deneysel koşullarında eksprese edilen genleri birbiriyle karşılaştırın. Bu örnekte, Venn diyagramı özelliği kullanılmaktadır. Bu gösterimde, yalnızca sakkaroz ve nişastanın kombinasyon etkileriyle ilişkili olan farklı eksprese edilen genlere odaklanıyoruz. Venn diyagramı tabanlı özellik, bu farklı koşullar altında eksprese edilen ortak ve benzersiz gen sayısını görselleştirmek için kullanılır ve daha ileri analizler için seçilecek genlerin belirlenmesine yardımcı olur.

Burada, burada gri olarak gösterildiği gibi C'de tespit edilenleri değil, yalnızca durum A ve/veya B'de kendine özgü olan diferansiyel eksprese edilen genleri seçiyoruz. MDV, analiz edilecek toplam gen sayısını büyük ölçüde azaltmış ve aynı zamanda deneysel durum için ilgili olmayan genleri filtrelemiştir. Dosya menüsünden, verileri kaydetmek için dışa aktarma seçeneğini belirleyin.

Sekme sınırlı dosyalar olarak, dosyalar daha sonra verilerin düzenlenebildiği ve istenen grafiksel gösterimlere dönüştürülebildiği Excel'de açılabilir. Excel'deki veri düzenlemesi, MDV çıktısının grafiksel olarak gösterilmesine olanak tanır. Bu grafik, biyofilm gelişiminin farklı aşamalarında nişasta ve sakkaroz kombinasyonundan etkilenen genlerin benzersiz fonksiyonel alt kümelerinin diferansiyel ekspresyonuna genel bir bakış sunmaktadır.

S mutantlarının transkriptomu üzerindeki etkiler, biyofilm gelişiminin 30. saatinde diğer zaman noktalarına göre daha belirgindir. Elde edilen sonuçlar, gen seçimini ve sonraki doğrulama sürecini kolaylaştıran zamansal etkiler göz önüne alındığında, çalışma hipotezimizle ilgili spesifik fonksiyonel gen alt kümelerini kesin olarak tanımlamamıza yardımcı olmuştur. Bu prosedürün ardından, organizmaların biyofilmler içindeki spesifik fizyolojik ve metabolik yanıtlarının neler olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için biyokimyasal ve proteomik yöntemler de uygulanabilir.

Bu denli kapsamlı ve entegre bir analiz, biyofilmlerin oldukça dinamik ve karmaşık bir ortam olan ağız boşluğunda patojeniteyi nasıl modüle ettiğinin daha iyi anlaşılmasına kesinlikle yardımcı olacaktır. Daha fazla ayrıntı için lütfen bu video makalesine ekli olan PDF dosyasına bakınız.