Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Bu prosedürün genel amacı, bir makromolekülün ligandına bağlanmasını tanımlayan doğru fiziksel modeli belirlemek ve ilişkili termodinamik parametreleri saptamaktır. Bu işlem, öncelikle kapsamlı bir diyaliz yoluyla makromolekülün bir stok çözeltisinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ilgili ligand son diyaliz tamponunda çözülür ve tüm bileşenlerin konsantrasyonları ikinci adımda belirlenir.

Makromolekül ve ligand örnekleri, dikkatle bir dizi farklı konsantrasyona seyreltilir. Ardından, prosedürün son adımında bir dizi ITC izotermleri oluşturmak için hem ligand hem de proteinin çeşitli konsantrasyonlarında bir dizi izotermal titrasyon kalorimetrisi veya ITC deneyi gerçekleştirilir. Deney serisinin küresel analizi farklı fiziksel modeller kullanılarak yapılır ve genel olarak en iyi uyumu sağlayan model doğru model olarak belirlenir.

Bugün size, protein moleküllerinin ligandlarına nasıl bağlandığı gibi biyofiziksel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilecek ve entropi, entalpi ve asosiyasyon sabitleri gibi bağlanma parametrelerinin doğru ölçümlerini sağlayabilecek bir yöntemi göstereceğim. Bu protokole başlamadan önce, ilgilenilen proteini saflaştırın; bu demonstrasyonda kullanılan makromolekül immuno GLYCOSIDE N six prime, bir sübtil transferaz 1 I veya C six prime 1 I'dir. Başlamak için, dört litre diyaliz tamponu hazırlayın ve dört °C'ye soğutun. Ardından, küçük bir hacimdeki makromolekül çözeltisini diyalize edin.

Bu durumda, 4 °C'de 1,3 litre diyaliz tamponu içerisinde 400 µM AAC C six prime, one eye'dan beş mililitre kullanılır. Bu işlem soğuk odada veya buzdolabında gerçekleştirilebilir; her sekiz saatte bir taze tamponla değişim yapılır ve toplamda üç kez diyaliz uygulanır. Son diyaliz çözeltisi saklanır.

Final diyaliz çözeltisinin 750 mililitresini 0,45 mikronluk bir selüloz filtreden süzün ve dört santigrat derecede saklayın. Bundan böyle çalışma tamponu olarak adlandırılacak olan bu tampon, durulama işlemlerinde ve seyreltici olarak kullanılacaktır. Numuneler için, 0,2 mikronluk bir şırınga filtresini çalışma tamponu ile iyice durulayın.

Protein örneğini uygulayın ve filtreleyin. Protein çözeltisini saklamadan önce örneği konik bir tüpe nazikçe toplayın, standart bir protein analizi ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Bu durumda, protein konsantrasyonu 280 nanometre dalga boyundaki ABSORBANS ile ölçülür ve enzim konsantrasyonu hesaplanır.

EXI proteomik sunucusundan elde edilen bir sönümleme katsayısını kullanarak, proteini uzun süreli stabiliteyi maksimize edecek şekilde saklayın. AAC C six prime one eye, dondurma ve çözme sonrası aktivitesini korumadığı için 4 °C'de saklanmalıdır; ardından ligandı ve çalıştırma tamponunu çözün. Bu gösterim için, 25 mM'lık bir stok çözelti hazırlamak amacıyla 4 mg asetil koenzim A, 200 µL çalıştırma tamponunda çözülmüştür.

Bu ligand, ITC örneklerini hazırlamaya hazır olana kadar -78 °C'de saklanabilir. Öncelikle, AAC 6'1 I için yazılı protokolde açıklandığı üzere, 64'lük bir C değeri elde etmek için enzim konsantrasyonunu hesaplayın. Bu, 192 µM'lık bir konsantrasyona karşılık gelir. Stok çözeltiyi filtrelenmiş çalışma tamponu ile seyrelterek, makromolekülün bu konsantrasyondaki 2 mL'lik çözeltisini hazırlayın. Asetal koenzim A çözeltisini buzlu su banyosunda çözdürün. Asetal koenzim A çözeltisi çözündüğünde nazikçe karıştırın. Ligand çözeltisinin konsantrasyonunu, makromolekül konsantrasyonunu bağlanma bölgesi sayısıyla ve ardından 10 ile çarparak hesaplayın.

80 µL 25 mM asetil koenzim A stok çözeltisini 420 µL çalışma tamponuna ekleyip karıştırarak asetil koenzim A çözeltisini hazırlayın. Seyreltilmiş asetil koenzim A çözeltisini bir pipet doldurma tüpüne aktarın ve kalan 25 mM stok çözeltisini saklamak üzere -78 °C'ye geri koyun. AC6'1I ve asetil koenzim A çözeltilerinin gazını, istenen deneysel çalışma sıcaklığının 1 °C altı olan 19 °C'de, vakum altında beş dakika boyunca alın.

Enjeksiyon şırıngasını hazırlamak için, önceden monte edilmiş şırınga klemesi tutucuyla aynı yüksekliğe gelene kadar şırıngayı şırınga tutucusuna yerleştirin. İkinci şırınga klemesini, şırınga tutucusunun tabanına sıkıca bastırılana kadar enjeksiyon şırıngasının üzerine geçirin. Sağlanan 0.05 inch bilyalı alyan anahtarı ile klemi nazikçe sıkın.

Ardından, şırınga tutucuyu pipet tutucunun içine yerleştirin. Pipet enjektörünü enjeksiyon şırıngasının içine nazikçe kaydırın ve piston ucunun doğrudan şırınganın deliğine girdiğinden emin olun. Tam olarak yerleştirildikten sonra, şırınga tutucunun kilitleme halkasını pipet enjektörüne vidalayın.

A a C six prime one eye protein numune çözeltisini yüklemeden önce, cihazla birlikte verilen hücre yıkama sistemini kullanarak numune hücresini en az 50 milliliters çalışma tamponu ile yıkayın. Numune hücresindeki kalıntı tamponu, uzun iğneli 2.5 milliliter cam şırınga ile aspirasyon yaparak uzaklaştırın. Gaz giderme vakumundaki çözeltileri, ikinci bir temiz ve kuru uzun iğne kullanarak uzaklaştırın.

2,5 mililitrelik şırınga. A a C six prime one eye protein örneğinden en az 1,8 mililitreyi şırıngaya dikkatlice çekin. Hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterin.

Şırınga protein örneği ile doldurulduktan sonra, iğneyi örnek hücresine yerleştirin ve hücrenin tabanına hafifçe değdirin. İğneyi yaklaşık bir milimetre yukarı kaldırın ve örnek hücresinin üst kısmında fazla sıvı görünene kadar örneği hücreye nazikçe enjekte edin. Hücrede hapsolmuş hava kabarcıklarını temizlemek için, taşma kısmında çözelti kaldığından emin olarak iğneyi yaklaşık bir santimetre yukarı kaldırın ve çözeltiden yaklaşık 0,25 mililitreyi hızla geri çekip tekrar enjekte edin.

Şimdi iğneyi, taşma haznesinin kenarı boyunca yavaşça yukarıya doğru kaydırın. İğne, örnek kuyusundaki bir çıkıntıya çarpacaktır. Bu çıkıntı, çalışma çözeltisi için istenen yüksekliği belirttiğinden, çıkıntının üzerinde kalan tüm sıvıyı çekin.

Enjeksiyon şırıngasını doldurmak için, plastik tüplü doldurma şırıngasını doldurma portuna takın ve piston ucunu doldurma portunun üst kısmına indirin. Ardından, DGAs ligand çözeltisinin pipet doldurma tüpünü pipet tutucunun altına yerleştirin. Şırınga ucunun doldurma tüpünün tabanına değmediğinden emin olun ve az miktarda çözelti doldurma şırıngasının tüpüne girene kadar çözeltiyi yavaşça şırıngaya çekin.

Ardından, piston ucunu indirerek doldurma portunu kapatın. Bu işlem, doldurma portunu kapatma düğmesine tıklanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, yükleme sırasında hapsolmuş olabilecek hava kabarcıklarını gidermek için işlem yapın.

Tahliye ve doldurma butonuna tıklayarak sistemi tahliye edin ve yeniden doldurun. Tahliye ve doldurma işlemini toplam üç kez tekrarlayın. Tahliye ve doldurma işlemi tamamlandığında, dolum tüpünü pipet tutucudan çıkarın ve şırınga ucunu laboratuvar peçetesiyle nazikçe silin.

Şimdi pipet düzeneğinin şırıngasını numuneye doğru indirin. İğne kolayca bükülebileceği için dikkatli olun ve yavaşça ilerleyin. Kilitleme halkasının tabanına bastırarak şırınganın tamamen yerleştiğinden emin olun.

Şırınga sabitlendikten sonra, istenen çalışma sıcaklığını ayarlayın ve beklenen maksimum enjeksiyon ısı akışından biraz daha yüksek bir referans güç seçin. Bu örnekte, çalışma sıcaklığı ve referans güç olarak sırasıyla 20 °C ve 20 µcal/s kullanılmıştır. Ardından, istenen enjeksiyon hacimlerini ve gecikme sürelerini programlayın.

Burada, ilki 2 µL hacminde olan ve 62. gecikme süresine sahip olan, sonraki enjeksiyonlar ise 10 µL hacminde olan ve 332. gecikme sürelerine sahip olan toplam 28 enjeksiyon kullanılmaktadır. Burada gösterilen deney, gerekli ek eğrileri oluşturmak için tek bir konsantrasyonda veri seti oluşturmanın temelini sağlar. Bu işlemi, azalan makromolekül ve ligand konsantrasyonları ile tekrarlayın.

Konsantrasyonlardaki hataları en aza indirmek için tüm makromolekül ve ligand örneklerinin aynı stok çözeltiden geldiğinden emin olun. Burada, 3,86 millimolar ligand asetil koenzim A'nın 192 micromolar mikro molekül A A C altı prim bir üzerine titrasyonundan elde edilen ham izotermal titrasyon kalorimetrisi izi gösterilmektedir.

Bağlanma parametrelerinin belirlenmesi için iki bölgeli ardışık uyum ile entegre göz değerleri kullanılmıştır. Bu grafik, farklı konsantrasyonlardaki ACE Koenzim A ve AAC C six Prime One Eye'nin ITC ile oluşturulan izotermlerini göstermektedir. Açık dairelerle temsil edilen deneysel veriler, hem iki set bağımsız bölge modeline hem de iki bölgeli ardışık modele uydurulmuştur.

İki bölgeli ardışık model ile daha iyi bir uyum görülmektedir. Kullanılan protein konsantrasyonları ek metinde tanımlanmıştır. Bu prosedür uygulanırken, konsantrasyonlardaki değişikliklerin sonuçlar üzerinde ciddi bir etkisi olabileceğinden, dilüsyonun çok hassas yapılması önemlidir.