Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Merhaba, ben Greg Zott. UCSF Diyabet Merkezi'ndeki Bluestone Laboratuvarı'ndayım ve bugün size fare adacıklarının izolasyon sürecini göstereceğim. Prosedür, C3 H donör faresinin pankreasına bir kollajenaz çözeltisinin enjekte edilmesini, ardından bu pankreasın çıkarılmasını, sindirilmesini, adacıkların bir yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırılmasını ve son olarak alıcımız olacak diyabetik bir NOD faresinin böbrek kapsülüne nakledilmek üzere elle seçilmesini içermektedir.

Bu prosedüre başlamadan önce, ATE çözeltimizi modifiye edilmiş bir Hanks tamponu ile seyrelttik ve kullandığımız fare suşu olan C3 H'ye özgü konsantrasyonu ayarladık. Sindirimlerin 0,8 mg/mL kollajenaz çözeltisinde daha iyi olduğunu tespit ettik ve pankreası genişletmek için ortak safra kanalına enjekte etmek üzere bu çözeltiyi kullanacağız. Prosedürü bugün Diyabet Merkezi'nden Pavo Codre gerçekleştirecektir. Fareyi açacak, bağırsakları ortaya çıkaracak ve ardından ortak safra kanalına enjeksiyon yapacaktır.

Tüyleri yatıştırmak için fareyi etanol ile spreyleyeceğiz ve ardından ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle farenin uygun şekilde sakrifiye edildiğini doğrulayacağız. Pavo şimdi midline insizyon ile fareyi açarak bağırsağı ve pankreası ortaya çıkaracak. Farenin sakrifiye edildiğini doğrulamak için diyafram da kesilecek.

Başlamadan önce, bazı önemli yapıları belirtmek istiyorum. Mide tam burada yer alıyor, pankreas ise alt taraftan duodenum'a ve üst tarafa bağlıdır. Safra kesesini ve hemen burada gördüğünüz ana safra kanalını bulacağımız yer ise karaciğerdir.

Şimdi Pavo'nun yapacağı işlem, ince bağırsağı izole etmek ve ortak safra kanalının ince bağırsağa girdiği noktayı bulmaktır. Bağırsak açığa çıktıktan sonra, ortak safra kanalının her iki yanını mosquito klemplerle sıkıştırıyoruz. Diğer gruplar klembi ortak safra kanalının üzerine yerleştirmeye çalışırken, biz bu yöntemin pankreasa daha fazla kolajenat girmesine izin verdiğini görüyoruz.

Bu tekniğin, enzimin pankreasa girmesini sağlamada daha etkili olduğunu saptadık. Bu, nazik bir işlemdir. Bağırsakların yırtılmasını istemezsiniz.

Klemplerin ana safra kanalının her iki yanına nazikçe yerleşmesini sağlamalısınız. Şimdi safra kesesini bulacağız ve safra kesesi açığa çıktığında, kolajenazın ana safra kanalına enjekte edilmesi için bunu bir kılavuz olarak kullanacağız. Powell, üç mL kolajenaz çözeltisi içeren beş cc'lik bir şırınga ile 30 gauge'lik bir iğne kullanıyor.

Ana safra kanalına girerken, kanalı kollajenaz çözeltisiyle genişletiyor ve bağırsak yakınlarına ulaşana kadar ana safra kanalı boyunca ilerliyor. Aşağı doğru ilerlerken, enzim çözeltileri pankreasa pompalanıyor/enjekte ediliyor. Pankreas kollajenaz çözeltisiyle şişirildiğinde, Powell hemostatları çıkaracak ve ardından pankreası bağırsaktan dikkatlice ayırarak fareden çıkaracaktır.

Organı mideden ayırıyor. Tamam, ardından dalağı tutacak olarak kullanarak pankreası yukarı kaldırıyor ve sonra ortak safra kanalından yavaşça kesip ayırıyor, işte bu kadar. Pankreas ortaya çıkarılıyor ve ardından dalak çıkarılıyor; burada mezenterik dokuyu temizliyor ve ardından pankreas, sterilize edilmiş cam bir şişe içindeki 2 mg/mL kollagenase çözeltisine yerleştirilerek tekrar buz üzerine konuluyor.

Cam tüplere koyduğumuz izole pankreas, şimdi yaklaşık 17 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirilecektir. Yüzeye çıkmamaları için tüpleri 50 ml'lik konik bir rafa yerleştirdik. Su banyosu sırasında zamanlayıcı başlatılır ve sindirim işlemi başlar.

Sindirimi süresi tamamlandığında, vialler çıkarılır, ardından sallanarak nazikçe parçalanır. Doku parçalanmaya başladığında, vial buz üzerine yerleştirilir. Yıkama tamponu içeren 400 ml'lik bir beherin üzerine steril bir süzgeç yerleştirilir.

Ardından pankreas digesti, süzgeç üzerinden dikkatlice yıkama tamponuna dökülür. Gösterim amacıyla, ne yaptığımızı görebilmemiz için çeker ocak kapatılmış ve camı kaldırılmıştır. Pankreas digesti behere döküldükten sonra, tüpler aynı yıkama tamponu ile durulanır ve yıkama tamponu süzgeç üzerine yerleştirilir.

Yıkama tamponu ile doldurulmuş bir şırıngamız var. Bunu, dokuyu süzgeçten zorlayarak yıkamak için kullanacağız. Buradaki amaç, matrise tutunmamış olan gevşek gözleri serbest bırakmak, ancak membranları ve sindirilmemiş dokuyu süzgeç üzerinde bırakmaktır.

Bir dokuyu yıkamayı bitirdiğinizde, prosedürün sonunda genellikle bunu görürsünüz. Tüpün dibindeki pankreas dokusu şimdi iki adet 50 ml konik tüpe aktarılacak; doku yıkanacak, homojen şekilde karıştırılacak ve ardından her tüpte eşit pellet hacmi olacak şekilde eşit olarak paylaştırılacaktır. Beher şimdi daha fazla yıkama tamponu ile durulanır.

Behere giren tüm dokuların geri alınması için kenarlar durulanır. Ardından, içerik her iki 50 ml'lik konik tüpe eşit olarak paylaştırılır. Daha sonra konik tüpler yıkama tamponu ile doldurulur.

Doku birkaç kez altüst edilir ve ardından bir santrifüje yerleştirilir. Bu, hızlı bir çevirmedir. Santrifüjün 1000 RPM hıza ulaşması beklenir ve ardından kapatılır.

Doku bu aşamada çok hassastır ve onları fazla sıkıştırmak istemezsiniz. Tüpler çıkarılır ve bu yıkama adımını üç kez daha tekrarlayacağız. Bu, üçüncü yıkamanın sonudur.

50 ml'lik konik tüpteki bileşenler 15 ml'lik konik tüpe aktarılır, 1000 rpm'de santrifüj edilir ve ardından durdurulur. Süpernatan uzaklaştırılır ve FI Call'un ilk aşamasına geçilir. Şu an, peletlenmiş pankreas sindirimine sahip olduğumuz aşamadayız.

Peletlerin üzerinden güzelce çözünmesi için dokuyu yeniden süspande edeceğiz. İlk yoğunluk gradyanı olan 1 1 0 8'i ekleyeceğiz. Her tüpe beş ml ekleyeceğiz.

Ardından pellet, gradyanların her birinde iyice karıştırılır. En ağır gradyanınızda iyi bir doku dağılımı elde etmeniz önemlidir. Şimdi, 1 0 9 6 yoğunluğunda iki ml ekleyeceğiz.

Ardından bunun üzerine, iki mil kalınlığında 1 0 6 9 yoğunlukta bir katman ve onun üzerine de 1 0 3 7 yoğunlukta bir katman ekleyeceğiz. Yoğunluk katmanlarını oluştururken bunları birbirine karıştırmamanız önemlidir. Böylece tüm katmanlar tüpe eklenmiş olur.

Burada 1 1 0 8'in, 9 1 0 9 6'nın, 1 0 6 9'un ve 1 0 3 7'nin üst kısımlarını görebilirsiniz. Santrifüjleme yapılmasa dahi dokunun halihazırda uygun yoğunluğuna doğru hareket etmeye başladığını görebilirsiniz. Final gradyanları 1800 RPM'de 15 dakika boyunca hızlandırılır ve tüpler santrifüjden çıkarıldıktan sonra frenin kapalı tutulduğundan emin olun.

0 0 9 6 ve 0 0 7 tabakası arasında, Pablo'nun belirgin bir adacık dokusu bandı görebilirsiniz. Şimdi, işlem sırasında salınmış olabilecek doku kalıntılarını ve DNA'yı temizlemek için 0 3 7 tabakası kaldırılıyor. Steril plastik bir pastör pipeti kullanarak, adacık tabakasını alacak ve bunları 25 mL yıkama tamponu içeren 50 mL'lik konik tüpe aktaracaktır.

Fol, eyeletler için toksik olduğundan bu adımı hızlıca yapmanız gerekir. Aslında 0 6 9 ve 0 9 6 katmanının tamamını kaldırdık. Pavo, plastik pastur pipetinin üst kısmını keser ve yıkama tamponu ile durular.

Gözilmekler daha sonra daha önce yaptığımız gibi santrifüj edilir. Santrifüj 1000 RPM hıza çıkarılır, ardından durdurulur ve üst faz aspire edilir. Gözilmekler, yıkama medyumu ile üç kez yıkanacaktır.

Böylece göz adacığı izolasyon sürecini tamamlamış olduk; digest aşamasından başlayarak fol gradyanına ve ardından üçüncü yıkama tamponu ile yıkamadan sonra saflaştırılmış göz adacıklarına ulaştık. Göz adacıklarını RPMI medyumunda yeniden süspanse ettik ve bir doku kültürü plağına yerleştirdik. Bu göz adacıkları artık in vitro analizler veya göz adacığı nakli gibi in vivo hazırlıklar için hazırdır.