Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, rastgele konik eğme yöntemini kullanarak ekzozom kompleksinin üç boyutlu yapısını elde etmektir. Bu işlem, öncelikle protein kompleksi için destek substratı oluşturmak amacıyla delikli karbon ızgara üzerine ince bir karbon film tabakası kaplanarak ve ikinci adımda boyama yapılarak gerçekleştirilir. Numune ve boya ızgara üzerine uygulanır, böylece numune ağır metal tuzları içine gömülür.

Ardından, numunenin eğim çifti mikrograflarını elde etmek için elektron mikroskobu uygulanır. Son olarak, rastgele konik eğim yöntemi kullanılarak yapılan görüntü analizi ile eksozom kompleksinin üç boyutlu yapısını gösteren sonuçlar elde edilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, bazen rastgele konik eğim yöntemi için numunenin iyi hazırlanmasının zor olması ve ardından gelen görüntü işleme prosedürü nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Örnek değerlendirmesinin görselleştirilmesi olmadan derecelendirme ve numune hazırlama adımlarını öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Rastgele konik eğme yönteminin prensibi, elektron mikroskobu içindeki bir numunenin aynı bölgesinden bir çift mikrograf alınmasını gerektirir. Fotoğraflardan biri numunenin eğilmemiş konumdayken, diğeri ise numune 50 ile 70 derece arasında bir açıyla eğilmişken çekilir. Bilgisayar kullanılarak, dijitalleştirilmiş mikrograf çifti yan yana getirilir ve bu gösterimde aynı partiküllere ait görüntüler seçilir.

Bu görüntüler üç boyutlu koordinatlardaki sayılarla işaretlenmiştir. Eğilmemiş parçacıkların görüntüleri ile onların eğilmiş eşleri, eğim ekseninin yönü ve eğim açısı ile birbirlerine ilişkilendirilir. Eğilmemiş parçacık görüntülerinin hizalanması, azimut alanını dolduran eğilmiş parçacıkların çok sayıda görüntüsünü kullanarak, eğilmiş parçacık görüntülerinin karşılık gelen asMule konumlarına gelmesini sağlar; böylece molekülün üç boyutlu yapısı, bir geri projeksiyon algoritması kullanılarak yeniden oluşturulabilir. Izgaraları hazırlamak için öncelikle, 100 mililitrelik bir cam behere 0,45 gram polivinil formal reçine ve 90 mililitre kloroform ekleyerek %0,5'lik bir form VAR çözeltisi hazırlayın.

Çeker ocak içerisinde, beheri alüminyum folyo ile kapatın ve form var reçinesini çözün. Küçük bir manyetik balık ve manyetik karıştırıcı yardımıyla reçinenin çözünmesi yaklaşık 15 dakika sürer. Bu sırada, önceden temizlenmiş mikroskopi cam lamlarını metanol ve Kim wipe ile temizleyin.

Formvar reçinesi kloroform içerisinde tamamen çözündükten sonra, çözeltinin yüzeyine bir mililitre %50 gliserol ekleyin. Eklenen gliserol hacminin ayarlanması, delikli karbonun delik yoğunluğunu etkiler.

Bir ultrasonik ucun ucunu çözeltiye daldırın. Yaklaşık bir inç derinlikte, maksimum gücü kullanarak bir dakika boyunca sonikasyon uygulayın; bu işlem, çözeltimizin formunda gliserol damlacıklarından oluşan bir emülsiyon oluşturacaktır. Daha uzun süreli sonikasyon, delikli karbondaki deliklerin boyutlarının küçülmesine neden olacaktır.

Bu adımdan sonra çözelti sütümsü bir hal alır. Sonikasyon banyosundan hemen sonra, temiz cam lamlar emülsiyonun içine dikey olarak daldırılır. Bir saniye sonra lamlar çıkarılır ve yüzeyde ince bir plastik film tabakası oluşturmak için lamların alt kısmı filtre kağıdı kullanılarak kurulanır.

Kloroform buharlaştıktan sonra, filmdeki deliklerin yoğunluğunu ve boyutunu ışık mikroskobu altında kontrol edin. Burada açıklanan hazırlama koşulları, 400 mesh'lik bir ızgaranın her karesinde çapları üç ile dört mikrometre arasında olan 10 ila 20 delik oluşturmalıdır. Cam lamlar kuruduktan sonra, lam yüzeyindeki plastik filmin kenarını kesin.

Slaytı dikey olarak suyun içine daldırarak filmi distile suyun yüzeyine çıkarın. Su yüzeyindeki ince film, ışık yansımasına karşı dar bir açıyla gözlemlenebilir. 400 mesh bakır ızgaraları, pürüzsüz yüzeyleri aşağı bakacak şekilde, tek tek filmin üzerine yerleştirin.

Üzerinde ızgaralar bulunan plastik filmi bir parça kâğıt yardımıyla kaldırın. Kâğıdı ters çevirin ve kurumaya bırakın. Bir Petri kabı içerisinde, deliklerdeki kalıntı gliserolü uzaklaştırmak için kâğıdı metanolde bekletin ve kâğıdın havada kurumasını sağlayın.

Gridleri yaklaşık 20 nanometre kalınlığında bir karbon tabakası ile kaplamak için bir karbon evaporatörü kullanın. İstenen kalınlığı kontrol etmek için evaporasyon süresini baz alın. Kalınlık, karbonun gri renginin, kalınlığı bilinen bir karbon tabakasının gri rengiyle karşılaştırılmasıyla belirlenebilir.

Formvar tabakasını uzaklaştırmak için karbon katmanlı ızgaraları bir cam petri kabında yarım saat boyunca kloroformda bekletin; ardından ızgaraların kurutulması sonucunda ev yapımı delikli karbon ızgaralar elde edilir. Sonrasında, yeni koparılmış bir mika yüzeyi üzerine yaklaşık 5 nm kalınlığında ince bir karbon tabakası buharlaştırın. Ardından, delikli karbon ızgaraları distile su altında bir filtre kağıdı parçası üzerine dikkatlice yerleştirin.

Ev yapımı bir düzenekte, ince karbonu mika yüzeyden su yüzeyine taşıyın ve yavaşça delikli karbon ızgaraların üzerine çöktürün. Üzerinde ızgaralar bulunan filtre kağıdını alın ve kurumaya bırakın. Çeker ocak içerisinde, taze %2 uranil format çözeltisi hazırlayarak ekzozom kompleksinin negatif boyama işlemine başlayın.

Yazılı prosedürde açıklandığı üzere, ışığa maruz kalmasını önlemek için çözelti tüpünü bir parça alüminyum folyo ile kapatın; çözelti aynı gün kullanılmalıdır. Bir glow discharge cihazı kullanarak, bir ince karbon tabakasını tamamen karbon ızgara üzerine glow discharge ile kaplayın. Ardından, tezgaha temiz bir parafilm parçası yerleştirin ve parafilmin üzerine 50 µL'lik üç damla uranil format boyama çözeltisi damlatın. Eksozom kompleksini, dilüsyon tamponu kullanarak yaklaşık 50 nM konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş proteinden 4 µL miktarında, glow discharge işlemi uygulanmış ızgara üzerine damlatın.

Numunenin ızgara üzerinde bir dakika kalmasına izin verin, ardından cımbız yardımıyla bir parça filtre kağıdı kullanarak kalıntı çözeltiyi emdirin. Izgarayı hemen ilk boya damlasının üzerine ters çevirin ve yaklaşık 10 saniye boyunca birkaç kez ileri geri hareket ettirerek ızgarayı durulayın. Bu işlemi üç boya damlasının her biri için tekrarlayın; son durulamadan sonra boyanın ızgara üzerinde bir dakika daha kalmasına izin verin.

Ardından, boyayı bir filtre kağıdı parçasıyla emdirerek temizleyin. Izgara yüzeyinde ince bir boya çözeltisi tabakası bırakın ve ızgaranın bir çeker ocakta kurumasını bekleyin. Numune ızgarasını numune tutucuya yerleştirin ve ardından tutucuyu bir FEI TE nine 12 elektron mikroskobuna yerleştirin.

En iyi boyanmış kareleri bulmak için örnek ızgarasını düşük büyütmede kontrol edin. İyi bir karede, boyutları yaklaşık bir ila iki mikrometre olan bir düzine delik ve bunların içinde koyu boyanmış alanlar olduğu görülür. FEI kullanıcı arayüzünün düşük doz modunu açın; ardından arama odağını ve pozlama konumunu düşük doz modunda hizalayın.

Aramayı, 1,5 metre kamera uzunluğunda olan fraksiyon moduna ayarlayın. Odağı 150 K büyütmeye, pozlamayı ise bir saniyelik ölçülen pozlama süresiyle 50 K büyütmeye ayarlayın. Normalde, hem arama hem de pozlama modunda ızgara üzerinde fark edilebilir bir özellik, hizalamayı gerçekleştirmek için kullanılır.

Arama modunda iyi boyanmış delikleri bulun ve konumlarını kaydedin. Karenin bir CCD fotoğrafını çekin. Numuneyi 55 dereceye eğin ve başka bir fotoğraf daha çekin.

İki resmi karşılaştırın ve iki mikrograftaki eşleşen delikleri belirleyin. Sahneyi tekrar sıfır dereceye getirin. Arama modunda belirlenen her bir deliğin yüksek büyütmede ve yaklaşık -0.7 µm defocus ile fotoğraflarını çekmek için düşük doz kitini kullanın.

Tüm deliklerin fotoğrafları çekildikten sonra, aynı büyütmeyi kullanarak tablasını 55 dereceye eğin. Eğik numunenin, yaklaşık eksi 1.2 µm defocus ile mikroğraflarını çekin. Ev yapımı delikli karbon gridlerin düzensiz desenlerini kullanarak, düşük büyütmeli mikrograflardaki desenlere dayanarak karşılık gelen eğim mikroğraf çiftini tanımlayın.

Korelasyona yardımcı olmak için, partiküllerin eşit dağıldığı ve partiküllerin etrafında halelerin bulunmadığı mikrograf eğim çiftlerini seçin. Verileri işlemek için, etraflarında belirgin boyama haleleri bulunan mikrograflar elenmelidir. Prosedürdeki program kurulumu ile başlayın.

Görüntü işleme, Eman paketindeki process 2D kullanılarak gösterilecektir. Görüntü formatını değiştirmek için iMagic five paketi kullanılarak 2D hizalama ve spider paketi uygulanır. 3D rekonstrüksiyon ve rafine etme işlemlerini gerçekleştirmek için, DM three Gatan dijital görüntüsünü spider görüntü formatına dönüştürün.

Process 2D komutunu kullanarak parçacık çiftlerini seçin. Spider program paketinde dağıtılan web programı kullanılarak, program parçacıkların koordinatlarını otomatik olarak kaydeder ve spider betiğini kullanarak seçilen tüm parçacıkları kutularla ayırır. Betik, eğimli ve eğimli olmayan parçacık yığınlarını kaydeder.

Eğim verilmemiş (untilted) parçacıkları IMAG five formatına dönüştürün. EM two EM programının band geçiren filtreleme özelliğini kullanarak, IMAG five'daki InCorp prep komutuyla eğim verilmemiş parçacıkları filtreleyin ve maskeleyin; ardından band geçiren filtreyle maskelenmiş parçacıkları center komutunu kullanarak merkezleyin. IMAG five'da, IMAG five programlarını otomatik olarak çalıştıran bir toplu işlem betiği (batch script) aracılığıyla parçacıkları iteratif olarak homojen sınıflara ayırın ve hizalayın.

Ardından, partiküllerin sınıf arama tablosunu oluşturmak için IMAG five'taki MSA names in class komutunu kullanın; header komutunu kullanarak her bir partikülün hizalama translasyon ve rotasyon değerleri için bir grafik dosyası oluşturun. iMagic five'da, EM two EM programını kullanarak hizalanmış partikülleri spider formatına dönüştürün. Daha sonra sınıflar arama tablosunu spider belge dosyalarına dönüştürün.

Her bir parçacığın hizalanmasına ilişkin öteleme ve rotasyon değerleri ayrıca bir spider doküman dosyasına dönüştürülür; eğimli parçacıklar, IMAG five'daki eğimli olmayan parçacıklarda olduğu gibi bant geçiren filtre ile maskelenir ve merkezlenir, ardından merkezlenmiş eğimli parçacıklar için yeni bir veri seti oluşturulur. IMAG five tarafından üretilen çoklu referans hizalama dokümanlarından ve web programı tarafından üretilen DCB dosyalarından açısal doküman dosyaları oluşturun. Her bir sınıf ortalaması için bir başlangıç modeli elde etmek amacıyla spider'daki geri projeksiyon betiğini kullanın.

Son olarak, RCT kullanarak nihai hacmi elde etmek için spider betiğini kullanarak tüm eğilmemiş partiküllere karşı başlangıç hacminin projeksiyon iyileştirmesini gerçekleştirin. Ekzosomun yaklaşık 50 yeniden yapılandırması elde edilmiştir. Hacimler, eğilmemiş partiküllerin 50 sınıfındaki her bir partiküle karşılık gelen eğilmiş partiküllerden oluşturulur.

Spider paketinde uygulanan geri projeksiyon (back projection) kullanılarak, projeksiyon eşleştirme iyileştirmesi gerçekleştirilmiştir. Bu hacimler başlangıç modelleri olarak kullanılarak ekzozomun yaklaşık 18 Å çözünürlükteki 3D hacmi oluşturulmuş ve ardından kompleksin farklı bölümlerine ait atomik modeller 3D haritaya yerleştirilebilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, numunenin uygun bir kontrastla hazırlanmasından mikroğrafların elde edilmesine ve nihayetinde görüntü analiz teknikleri kullanılarak yeniden yapılandırmanın gerçekleştirilmesine kadar, 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için RCT'nin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. Burada tanımladığımız protokolün yanı sıra, görüntü analizinde nihai rekonstrüksiyonları elde etmek için çeşitli yöntemler bulunmaktadır.

Güvenilir ve doğru bir rekonstrüksiyon elde etmek için en kritik adım, iyi hazırlanmış bir örnekle çalışmaktır.