Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

Bu prosedürün amacı, odaklanmış iyon demeti ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak beyin dokusunun belirli bir bölgesinden seri görüntüler toplamaktır. Bu işlem, öncelikle beynin boyanan ve ardından reçineye gömülen dilimler halinde kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, gömülü beyin kesitinden ilgilenilen bölgenin kesilip boş bir reçine bloğuna monte edilmesidir.

Üçüncü adım, reçine bloğun bir ultra mikrotom ile düzeltilmesi ve sadece görüntülenmesi istenen bölgeyi izole etmek için mikroskobun iyon demetinin kullanılmasıdır. Son adım, her görüntü alınmadan önce ince tabakaların tekrar tekrar kaldırılması için iyon demeti kullanılarak reçine bloğun bir yüzeyinin seri şekilde görüntülenmesidir. Nihayetinde, bir ilgi alanı boyunca seri görüntülerin yer aldığı sonuçlar elde edilebilir.

Görüntü serisi otomatik olarak toplanır ve veri kümesi genellikle izotropik voksellere sahiptir, böylece görüntü yapıları yığındaki herhangi bir açıdan görüntülenebilir. Bu tekniğin seri kesit transmisyon elektron mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha yüksek Z çözünürlüğü sağlayabilmesidir. Elektron tomografisi ile karşılaştırıldığında ise, reçineye gömülmüş örnekler için optimal bir çözünürlükte çok daha büyük hacimleri görüntüleyebilmektedir.

Prosedür, anestezi uygulanmış ve perfüze edilmiş bir sıçanın fikse edilmiş beyninin diseke edilmesiyle başlar. Beyni, plastik bir kalıba sıcak %5 aeros içerisine gömün; aeros donmadan önce beyni doğru açıya getirin, ardından içinde beyin bulunan aeros bloğunu bir vibratom dilimleyici kullanarak örnek tutucuya monte edin. 80 mikron kalınlığında koronal kesitler alın ve ilgi bölgesini kapsayacak kadar kesit kesin.

Ardından numuneleri 20 mililitrelik cam izolasyon tüplerine yerleştirin. Her tüpe 10 adede kadar kesit yerleştirin. Numuneleri 0,1 molar K coate tamponu ile her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.

Ardından numuneleri 0.1 molar K coate tamponunda %1,5 potasyum siyanür ve %1 osmiyum tetroksit ile 30 dakika boyunca boyayın. Numunelerin boyanmasına 0.1 molar K coate tamponunda %1 osmiyum tetroksit ile 30 dakika daha devam edin. Bunu takiben, numuneleri çift distile su ile üç dakika boyunca bir kez durulayın, ardından çift distile suda %1 al asetat ile 30 dakika boyunca boyayın.

Ardından, kesitleri beş dakika boyunca çift distile su ile durulayın ve ardından her değişim için iki dakika ayırarak dereceli bir alkol serisinde dehidre edin. Bir sonraki adım, kesitleri alkol ile karıştırılmış artan konsantrasyonlardaki Duran reçinesine gömmektir; değişimler arasında 30 dakika bekleyin. %50 etanol ve %50 reçine ile başlayın, ardından %30'a %70, sonra %10'a %90 ve son olarak kesitleri 30 dakika boyunca %100 reçinede tutun.

Ardından besiyerini %100 taze duran reçine ile değiştirin. Roller karıştırıcıda bir saat boyunca yavaşça çalkalayın. Gömme işleminin ardından, kesitleri önceden kalıp ayırıcı ajanlarla kaplanmış cam mikroskop lamlarına yerleştirmek için ahşap bir kokteyl çubuğu kullanın.

Slaytlara mümkün olduğunca fazla kesit yerleştirin, ancak slaytları aşırı doldurmamaya dikkat edin. Mikroskop lamları arasına bir kimlik etiketi yerleştirildiğinden emin olun. Lamları 24 saat boyunca 65 °C'lik bir fırında bekletin.

Ertesi gün, örnekleri fırından çıkarın. Cam mikroskop lamlarının arasına nazikçe bir jilet itin ve örnekleri içeren reçine tabakasını, parmaklarınızla tutarak lamların arasından çıkarın. Örneği akan su altında nazikçe yıkayın.

Kalıp ayırıcı maddeleri temizlemek için, numuneyi düşük güçlü bir objektif kullanarak iletimli aydınlatmaya sahip bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. İlgilenilen bölgeyi ince bir iğne ile işaretleyin. İlgilenilen bölgenin etrafında üç milimetreye üç milimetrelik küçük bir kare kesmek için bir ustura bıçağı kullanın.

Küçük reçine bloğu boş bir reçine bloğunun üst kısmına yapıştırmak için akrilik yapıştırıcı kullanın. Ardından, bloğu ultra mikrotom tutucusuna sabitleyin. Bağlı olan stereo mikroskop üzerinden bakarak, sadece küçük bir malzeme piramidi kalana kadar ilgi bölgesinin etrafını jiletle kırpın.

Ultra mikrotoma sabitlenmiş bir cam bıçak kullanarak, bloğun kenarını ilgi bölgesine yakın bir noktadan ve bloğun üst yüzeyine açılı olacak şekilde kesin. İlgi bölgesinin, blok yüzeyinin boyutlarına göre hassas bir şekilde konumlandırılabilmesi için bloğu daha fazla tıraşlayın. Bloğu ultra mikrotomdan çıkarın ve bir geçirimli ışık mikroskobunun altına yerleştirin.

İlgi bölgesini fotoğraflayın. Budanmış bloğu, karbon boya ile kalan reçine sapından ayırmak için bir kuyumcu testeresi kullanın. SA'yı bloktan ayırıp bir SEM numune tutucuya sabitleyin ve görüntülenecek taraf en dış kenara bakacak şekilde yönlendirin.

Yapıştırıcı kuruduktan sonra, preparatı bir püskürtme ve vakumlu evaporasyon sistemine aktarın ve bloğu 20 nanometreden daha kalın ince bir altın tabakasıyla kaplayın. Reçineye gömülmüş doku bloğu, odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobunda görüntülenmeye hazırdır. Numuneyi tutucusuyla birlikte düşük büyütmede mikroskoba yerleştirin ve ikincil elektron görüntüleme kullanarak bloğu, ilgi bölgesi ve görüntülenecek blok yüzeyi karşı karşıya gelecek şekilde yönlendirin.

Operatör, görüntülenecek yüzey frezeleme demetine paralel olacak şekilde bloğu yönlendirir. Bu işlem, 13 ila 27 nano amps iyon demeti akımı ve 30 kilovolts gerilim kullanılarak, elektron demetinin bu yüzeye 54 derece açıyla yönlendirilmesini sağlar.

Görüntülenecek bölgenin ön kısmından dar bir reçine şeridini kaldırın. Ardından, ilgi bölgesinin üzerinde yer alan frezelenmiş yüzeyi görüntülemek için geri yansıtmalı görüntüleme moduna geçin. Daha önce alınmış olan ışık mikroskobu referans görüntüsünü ve frezelenmiş yüzeyin görüntüsünü kullanarak, mikroskobun gaz enjeksiyon sistemini kullanarak blok üzerinde frezelenecek ve görüntülenecek olan kesin bölgeyi belirleyin.

700 picoamps akım kullanarak, ilgi bölgesinin üzerindeki blok yüzeyine yaklaşık bir mikron kalınlığında karbon veya metalden oluşan koruyucu bir tabaka kaplayın. Son olarak, blok üzerinde nihai görüntülerin alınacağı bölgeyi frezeleyin. Frezeleme ışınının, yüzeyde hiçbir frezeleme artefaktı görülmeyene kadar bu görüntü yüzeyini tamamen frezelemesine izin verin.

Yüzeyin seri görüntülemesi için mikroskop parametrelerini seçin. Tipik parametreler, 1.2 ile 2 kV arası voltajlar ve 4 ile 20 nm arası piksel boyutlarıdır. Yüzeyi işlemenin ve bir görüntü elde etmenin toplam süresinin iki dakikanın altında olması için piksel bekleme süresi yaklaşık 10 µs olmalıdır.

Termal değişikliklerin dengelenmesi için mikroskobu en az iki saat dinlendirin. Ardından, ilgi bölgesinden seri görüntüler elde etmek için frezeleme ve görüntüleme işlemini başlatın. Bu şekil, wrap brain içindeki ultra yapıyı gösteren blok yüzeyinin ters kontrastlı geri saçılma görüntüsünü göstermektedir.

Tüm membranların yanı sıra büyük makromoleküler yapılar da görünür durumdadır. Bu şekil, beş nanometre aralıklarla toplanan toplam 1.600 görüntüden oluşmakta olup, izotropik voksellere sahip bir görüntü yığını meydana getirmektedir. Bu yığın, herhangi bir düzlemde aynı çözünürlükle görüntülenebilir.

Böylece bu videoyu izledikten sonra, odaklanmış demet taramalı elektron mikroskobu ile seri görüntüleme için beyin dokusunun nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.