ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

Bu prosedürün genel amacı, bir milyon hücreden elde edilen toplam hücresel nükleozom preparasyonlarındaki post-translasyonel modifikasyonların göreceli seviyelerini doğru bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle yüksek kaliteli homojen memeli hücresi kültürleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, bir Dounce homogenizatörü ile mekanik parçalama ve santrifüjasyon yoluyla hücrelerden çekirdekler izole edilir.

Bir sonraki adım, çekirdeklerde bulunan kromatini sindirerek ve bir dizi hipotonik ekstraksiyon gerçekleştirerek sağlam nükleozomlar elde etmektir. Son olarak, spesifik translasyon sonrası modifikasyonları belirlemek için uygun kontrollerle birlikte bir ELISA testi kullanılarak nükleozomlar analiz edilir. Nihayetinde, nükleozom örneklerinde bulunan spesifik modifikasyonların göreceli seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin western blotting ve kromatin immünopresipitasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, birçok nükleozom modifikasyon durumunun genel bir tablosunun kolayca belirlenebilmesidir. Yöntem, western blotting'den çok daha hassas ve doğrudur ve genel moleküler biyoloji deneyleri için donanımlı çoğu laboratuvarda uygulanabilir. Bu yöntem, temel diferansiyasyon ve yeniden programlama olayları meydana geldiğinde neler olduğu gibi, kök hücre ve epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedüre başlamak için, önce hücreleri her 15 cm'lik plak için üç mililitre tripsin kullanarak taze tripsinize edin. 20 mililitre buz gibi soğuk PBS bütirat ekleyin. Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri toplamak için tübü 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve yıkama için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS bütirat ekleyip hücre süspansiyonunu tekrar 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini, yazılı protokolde açıklandığı gibi proteaz inhibitörleri içeren dört mililitre lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri buz üzerinde B tipi havanlı bir homojenizatöre pipetleyin ve 20 darbe ile homojenize edin. Daha sonra homojenatı buz üzerinde bir santrifüj tüpüne aktarın.

Numuneyi 2000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Dört santigrat derecede. Sitoplazmik materyali içeren süpernatantı uzaklaştırın ve resüspansiyon yapın.

Pelleti, proteaz inhibitörleri içeren iki mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu C içinde süspande edin; resüspande edilen materyali, soğuk bir santrifüj tüpündeki beş mililitre %30 sükroz yastığının üzerine nazikçe katmanlandırın. Çekirdekleri izole etmek için, salıncak kovalı bir rotorda 2.400 G'de beş dakika santrifüjleyin; çekirdekler yastık boyunca göç edecek ve hücresel debris ara yüzeyde kalacaktır. Santrifüjden sonra, tüm sıvı hacmini dikkatlice uzaklaştırın ve çekirdekleri proteaz inhibitörleri içeren 250 mikrolitre buz gibi soğuk yıkama tamponu C içinde yeniden süspande ederek çekirdekleri 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Nükleozomların izolasyonuna başlamak için, çekirdeklere üç µL 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin ve sıcaklık dengelenene kadar 37 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin. Ardından, 10 µL mikrokokal nükleaz tamponu içindeki iki ünite mikrokokal nükleaz ekleyin ve 37 °C'de 12 dakika boyunca inkübe edin. Bir pipet ucuyla sık sık karıştırın.

İnkübasyon sonrası, reaksiyonu altı mikrolitre 0.5 molar sodyum EDTA-pH 8 ile durdurun ve soğuması için buza yerleştirin. Ardından, örneği 2000 G'de dört dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından üst fazı atın ve peleti resüspande edin. Örneği 300 mikrolitre 0.2 milimolar sodyum EDTA içinde, karıştırmak için ara ara nazikçe pipetleyerek bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.

4 °C'de dört dakika boyunca 3000 G'de santrifüjlemeden sonra, serbest nükleozomları içeren süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne toplayın ve ek nükleozom yeniden kullanımı için buz üzerinde saklayın. Peleti, daha önce olduğu gibi 300 µL 0.2 mM sodyum EDT içinde süspanse edin ve ara ara nazikçe karıştırarak bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyonun ardından örneği santrifüj edin. Oluşan süpernatantı, buz üzerindeki mikro santrifüj tüpünde kalan örnekle tekrar birleştirin. Nükleozom ELISA testi için, en üst kuyucukta 50 µL başına 0,1 µg ile başlayan, nükleozomlar ve kaplama tamponu ile hazırlanmış beşli, iki katlı seri dilüsyon dizisini 96 kuyucuklu bir ELISA plakasına yükleyin; tüm dilüsyon serileri üç paralel (triplicate) şeklinde yüklenmelidir.

Kontrol olarak sadece kaplama tamponu içeren kuyucuklar eklemeyi unutmayın. Plakayı dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, kuyucuk başına 200 microliters %0,5 PBS ile plakaları toplam 10 dakika sürecek şekilde dört kez yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın.

Şimdi her kuyucuğa 100 µL bloklama çözeltisi ekleyin ve bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, plakayı ters çevirip lavabo üzerinde sertçe sallayarak bloklama tamponunu uzaklaştırın. Ardından, her kuyucuğa 50 µL hacminde, %0,05 Tween 20 içeren PBS içinde %5 PSA çözeltisinde seyreltilmiş primer antikoru ekleyin ve çözeltiyi bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Birincil antikor inkübasyonunun ardından, plakaları daha önce olduğu gibi plaka yıkayıcıyı kullanarak yıkayın. Yıkama işlemi tamamlandığında, her kuyucuğa %5 BS, A ve %0,5 20 içeren PBS içinde seyreltilmiş 50 µL horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ekleyin ve bir rotator üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İkincil antikor inkübasyonunu takiben plakaları daha önce olduğu gibi yıkayın.

Plakayı geliştirmek için plaka yıkayıcı kullanın. Her kuyucuğa 50 µL TMB Eliza substratı ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, ELIZA plağındaki kuyucuklar maviye dönecek ve renk yoğunluğu, her birindeki nükleozom modifikasyonlarının miktarı ile orantılı olacaktır.

Ardından, kuyuk başına 50 µL iki normal sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Renk kahverengiye dönecektir; hava kabarcıklarını gidermek için plakayı 1500 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Plaka artık bir kolorimetrik plaka okuyucu ile nicelleştirme için hazırdır. Son olarak, plakayı 450 nanometrede okuyun ve analiz için sonuçları dışa aktarın. Bu teknik uzmanlaşıldığında ve geliştirildikten sonra uygun şekilde yürütülürse iki günde tamamlanabilir.

Bu teknik, kök hücre araştırmaları alanındaki araştırmacıların, diferansiyasyon ve yeniden programlama olaylarına verilen epigenetik yanıtları tüm epi proteom düzeyinde incelemelerinin önünü açmıştır.