İnsan Nöral Kök Hücreler Pasajlanması

Merhaba, ben Steve. UC Irvine Patoloji Bölümü'nde Dr. Flanagan'ın laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size insan nöral öncül hücrelerinin nasıl pasajlanacağını göstereceğim.

Bu teknik, yeni bir flaskın insan fibronektin çözeltisi ile kaplanmasını, hücrelerin hücre disosiasyon tamponu ile yüzeyden ayrılmasını, ardından hücre disosiasyon tamponunun %10'luk serum çözeltisi ile nötralize edilmesini, hücre süspansiyonunun santrifüjlenmesini, hücrelerin taze besiyerinde yeniden süspanse edilmesini ve hücre süspansiyonunun yeni bir flaska aktarılmasını içerir. Laboratuvarımızda, insan nöral öncül hücrelerini her iki günde bir besiyerlerinin yarısını değiştirerek kültüre ediyoruz ve yaklaşık haftada bir kez bire bir veya bire iki oranında bölerek pasajlıyoruz. Hücreleri pasajladığımda, eğer onları bir immünokimya deneyi için ayırmak istiyorsam veya nükleer bir efektör ile transfeksiyon yapmak istiyorsam hücreleri sayabilirim.

Hücreleri paketlerken hücre ayrıştırma tamponu kullanmak önemlidir; çünkü öncelikle, tripsinin aksine enzimatik değildir ve hücreler üzerinde çok daha yumuşak bir etkiye sahiptir. Merhaba, şu an doku kültürü odasındayız ve size konfluen bir insan öncül hücre flaskının nasıl göründüğünü göstermeden önce, doku kültürünü hazırlayacağım. İlk olarak, UV ışığını kapatıp normal ışığı ve hava akışını açacağım.

Ardından, bir kağıt havluyu %70 etanol ile püskürterek ve kabini silerek kabini dezenfekte edeceğim. %70 etanolü doğrudan kabinin içine değil de bir kağıt havluya püskürtmek önemlidir; çünkü kabine %70 etanol püskürtmek, oldukça pahalı olan HEPA filtreye zarar verebilir. Sonrasında, tüm reaktiflere ve ekipmanlara püskürtme yapacağım.

Ve son olarak, vakum hortumlarını spreyleyeceğim ve böylece her şeyi tamamlamış olacağız. Şimdi bu hücrelere bir bakalım. Bu hücreler yaklaşık %80 konfluenste görünüyor.

Bunlar insan fetüslerinden izole edilmiş insan nöral öncül hücreleridir ve bunları T 25 flasklarda büyütüyoruz. Hücreleri yaklaşık her hafta bir veya iki katı oranında bölüyoruz. Şimdi hücrelerimi pasajlamaya hazırım.

İlk olarak, BD biosciences'tan alınan insan fibronektini ile dört saat boyunca kapladığım yeni bir T 25 flask getireceğim. Fibronektin solüsyonunu uzaklaştırdım. Hücreleri flask'a aktarmadan önce bu flask'ı BBS ile durulayacağım.

Şimdi hücreleri 37 °C'lik inkübatörden çıkaracağım. İşte buradalar. Şimdi, insan fibronektini ile kaplanmış olan yeni flasktaki PBS yıkama solüsyonunu uzaklaştıracağım.

Yeni flaska iki mililitre eski kondisyonlu besiyeri ekleyeceğim. Şimdi, hücreleri yüzeyden ayırmadan önce PBS ile durulamam gerekiyor. Bu nedenle öncelikle, hücrelerin kurumasına izin vermeden mevcut besiyerini uzaklaştıracağım ve hemen ardından yaklaşık iki ml PBS ekleyeceğim.

Hücreleri flakon yüzeyinden ayırmak için PBS'yi uzaklaştırmadan ve hücre ayırma tamponu eklemeden önce yaklaşık iki dakika bekleyeceğim. Şimdi PBS'yi uzaklaştırıyorum ve hücrelerin kurumaması için hücre ayırma tamponunu hemen eklemeye çalışacağım. Bu nedenle 1.5 mL hücre ayırma tamponu ekleyeceğim.

PBS'den farklı olarak, bunu doğrudan hücrelerin üzerine ekleyeceğim ve mümkün olduğunca geniş bir yüzeyi kaplamaya çalışacağım. Bu nedenle, tampon çözeltiyi hücrelerin üzerine yavaşça eklerken erleni yanlara doğru hareket ettiriyorum. Hücrelerin yüzeyden ayrılmaya başlaması için şimdi yaklaşık beş dakika bekleyeceğim.

Ardından flaskı çeker ocak içinde oda sıcaklığında bırakacağım. Burada görebileceğiniz gibi, hücreler önce yuvarlaklaşmaya başlar ve ardından yüzeyden ayrılmaya başlarlar; hatta bazı hücrelerin şimdiden yüzdüğünü görebilirsiniz. Flaskın yan tarafına hafifçe vurduğunuzda, bu durum hücrelerin ayrılmasına yardımcı olacaktır.

Beş dakika geçti ve gördüğünüz gibi, yüzeyden ayrılan hücrelerle birlikte çözelti oldukça yoğun hale geldi. Şimdi, 4,5 ml serum içeren besiyeri ekleyerek hücre ayrıştırma tamponunun etkisini nötralize edeceğim. Bunun için DMEM-F12 besiyeri içinde %10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu kullanacağım ve yüzeye yapışık hücre kalmadığından emin olmak için bunu doğrudan flask yüzeyine ekleyeceğim.

Ardından, kalan hücreleri serbest bırakmak için pipetle nazikçe yukarı aşağı hareketler yapacağım. Sonrasında hücre solüsyonunu 15 ml'lik konik bir tüpe aktaracağım ve bir dakika boyunca 1000 RPM hızında santrifüj edeceğim.

Hücrelerin santrifüj işlemi tamamlandı ve burada güzel bir hücre peleti elde ettik. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek serumlu medyumu çok dikkatli bir şekilde uzaklaştıracağım. Ardından, peleti 4 mL medyum içinde yeniden süspanse edeceğim.

Şimdi, çözeltinin homojen hale gelmesi ve içinde hiçbir topak kalmaması için pellet'i, hücre kümelenmeleri kalmayacak şekilde yeniden süspande etmeye çalışacağım. Bir'e iki oranında ayırma işlemi yaptığım için, dört mL'nin iki mL'sini alıp halihazırda iki mL kondisyonlu besiyeri içeren yeni flaska aktaracağım. Son olarak, flask'ı hücre tipi, pasaj numarası ve tarih ile etiketleyeceğim.

Bu, yarım saat önce pasajladığımız hücrelerin görünümüdür. Görebileceğiniz üzere, hücrelerin çoğu yüzeye tutunmuş ve uzantılar çıkarmaya başlamıştır. Hepsi bu kadar.

Ve şimdi sayıma hazırım.