Tek Hücre Transcriptome Analizi

Bu prosedürün genel amacı, transkriptom analizi için tek hücrelerden örnekler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle izolasyon için uygun bir hücre bulunarak gerçekleştirilir. Ardından, mikro pipet izole edilecek hücrenin yanına konumlandırılır.

Ardından, hücre mikro pipet ucuna çekilene kadar şırıngaya vakum uygulanır. Prosedürün son adımı, mikro pipet ucunun toplama tüpü içine kırılarak ayrılması ve mikro pipetin kalan içeriğinin tüpe boşaltılmasıdır. Sonuç olarak, protokolde ayrıca açıklanan RNA amplifikasyon yöntemi kullanılarak amplifiye edilen materyallerin mikroarray analizi veya PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar aracılığıyla, hücreler arasındaki mRNA popülasyonlarındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, tek hücreler arasındaki farklar ve işleyiş hakkında bilgi sağlayabilse de, dendritler veya belirli dendrit sınıfları gibi hücre altı kompartmanlara da uygulanabilir ve dendrit fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sunabilir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Jennifer Singh uygulamalı olarak gösterecektir. Bu protokolün başlangıcından önce, embriyonik 18. gündeki sıçan Hippo Campi'den alınan primer nöronlar, 35 milimetrelik bir kap içerisindeki 12 milimetrelik lameller üzerine ekilmiş ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde muhafaza edilmiştir. Toplama pipetlerini hazırlamak için, otoklavlanmış cam pipetleri elektrofizyolojiye uygun bir çapa çekmek amacıyla bir mikro pipet çekici kullanın.

Üreticinin ön ayarlı programı kullanıldığında, uç hücre toplama öncesinde kırılacağı için delik boyutu kritik değildir. Pipetleri, hücre toplama aşamasına gelindiğinde uçların sağlam kalacağı şekilde, mikro pipet saklama kavanozu gibi tozsuz bir ortamda dikkatlice saklayın. Toplanan materyallerin saklanması için iki mikrolitre PBS ekleyerek istenen sayıda 1,7 mililitrelik einor tüpü hazırlayın.

Doku kültürü kabininde, inkübatörden 1 adet 35 milimetrelik lamel içeren kap çıkarın. Bu kaptaki bir lameli hızla HBSS içeren yeni bir 35 milimetrelik kabın kapağına aktarın. Hücreler sağlıksız hale geleceği için, işlem yapılmayan lamellerin inkübatöre geri döndürülmesi kritik önem taşır.

Uzun süreler boyunca dışarıda bırakılırsa. Hücre hasadı için mikro manipülatörle donatılmış 40 x objektifli bir ters ışık mikroskobu gereklidir. Tutucudan uzağa yönelen esnek tüplere sahip bir pipet tutucu kullanın; toplama sırasında pipetin istenmeyen hareketlerini önlemek için tüpleri sabit bir yüzeye sabitleyin.

Borunun ucuna, luer lock bağlantılı bir mililitrelik şırınganın takılabilmesi ve kullanıcılar arasında değiştirilebilmesi için bir iğne yerleştirin. Bir elin parmakları arasında gergin tutulan bir Kim wipe üzerine, pipet ucunu bir ila iki kez çok nazikçe sürterek ucu kontrollü bir şekilde kırıp mikropipeti hazırlayın. Açıklık, hedef hücre boyutunun yaklaşık %75 ila %100'ü kadar olmalıdır.

Mikropipeti mikropipet tutucusuna sabitleyin ve mikropipet tutucusunu mikro manipülatörlerdeki ek parçaya takın. Son olarak, 40 x objektifi ayarlayın. Kabı mikroskop tablasına yerleştirin ve hasat için uygun bir hücre bölgesi bulun.

Primer nöron kültürleri durumunda, hücre komşularından nispeten izole olmalıdır. Çevre hücrelerin ve/veya uzantıların toplanmasını önlemek için, toplanacak hücreyi görüş alanının merkezine yerleştirin. Mikro pipeti kapta bulunan solüsyonun içine ve ışık yoluna doğru ilerletmek için mikro manipülatörü kullanın.

Pipet ucunu solüsyonun içine indirin. Okülerden bakıldığında, pipet görüş alanında bir gölge şeklinde görünmelidir. Bu noktadan itibaren, hücre düzleminin oldukça üzerinden şırıngayla hafifçe üfleyerek pozitif basınç uygulayın.

Pipet ucunu görüş alanı içerisine girene kadar konumlandırın ve kaba odaklama düğmelerini kullanarak pipet ucuna odaklanın. Bu noktada, pipetin iç çapının çok büyük veya çok küçük olup olmadığını değerlendirin. Toplama bölgesinde pipetin kırılmasını önlemek için, doğru iç çap bulunana kadar başka bir mikro pipet ile değiştirin.

Mikromanipülatörleri kullanarak pipet ucunu hücrelere doğru ilerletmeden önce, odak düzlemini ilerletmek için kaba odak ayarını kullanın. Hücreler yaklaştıkça, hem hücreler hem de pipet ucu netleşene kadar ince odak ayarını kullanın. Hedef hücrelere ulaşmadan önce, onları lam üzerine üfleyip uzaklaştırmamak için pozitif basınç uygulamayı durdurun.

Pipet ucunu, hasat edilecek hücre somasına değecek şekilde mikro manipülatörler ile konumlandırın. Şırıngayı kullanarak, hücre pipet ucuna girene kadar ağızla hafifçe vakum uygulayın. Eğer hücre pipete girmiyorsa, pipet ucunu hücreye doğru hafifçe yaklaştırın ve lamelden kalkana kadar aşağıya doğru hareket ettirin.

Pipeti hemen yukarı hareket ettirmek ve çözeltiden çıkarmak için mikro manipülatörü kullanın. Pipeti tutucudan çıkarın. Hazırlanan 1,7 mililitrelik ependorf tüpünü bir elinizde tutun ve pipet ucunu, tüpün alt kısmına doğru yan tarafında nazikçe kırın.

Kırık uç tüpün içinde ortalanmış şekildeyken 0,1 mililitre işaretini hedefleyerek, bir mililitrelik bir şırıngaya takılı iğneyi pipetin üst açıklığından içeri yerleştirin. Pistonu hızla aşağı iterek pipetteki solüsyonun tüpün içine püskürmesini sağlayın. Ucun tüpün kenarlarındaki herhangi bir sıvıya temas etmemesine dikkat edin.

Kılcallık etkisi sıvıyı pipete geri getireceği için, hücre pipetin tam ucunda kalmalıdır ve bu durum hücrenin uygun şekilde dışarı atılması için yeterli olmalıdır. Tüpün içeriğini bir masaüstü mikro santrifüj kullanarak hızla çöktürün ve ileri işlemler veya PCR ya da yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar için kuru buz üzerinde dondurun veya buz üzerinde muhafaza edin. Burada, izole edilmiş bir nöronun başarılı bir şekilde hasat edilmesine dair bir örnek gösterilmiştir.

Başlangıç olarak, nispeten düşük yoğunluklu bir hücre bölgesi seçildi. Ardından pipet ucu, hedeflenen hücreye doğru ilerletildi. Burada, hücre toplandıktan sonraki görüş alanı gösterilmektedir.

Çevreleyen süreçlerin lamel üzerinde kaldığına dikkat edin. Buna karşılık, bu şekil, etkili toplama için uygun olmayan boyuttaki iki pipet ucu görüntüsünü göstermektedir. Bu uç eksik toplamaya yol açarken, burada gösterilen uç ise çevreleyen ortamın toplanmasıyla sonuçlanacaktır.

Hasat ve RNA amplifikasyon analizinin ardından, amplifiye edilmiş RNA'nın dağılımını ve miktarını incelemek için bir bioanalyzer kullanılması önerilir. Tek hücre materyalinden gerçekleştirilen başarılı bir amplifikasyon, düşük mikrogram seviyelerinde toplam miktar sağlayacak ve pürüzsüz ve geniş bir dağılıma sahip olacaktır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde dakikalar içinde tamamlanabilir; bu prosedür gerçekleştirilirken RNA içermeyen tekniklerin kullanılması önemlidir.