Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dokuya özgü lipaz ve GAL 80 dönüştürme araçlarının kullanımı yoluyla GAL4 ekspresyonunu rafine etmektir. Bu, bir dizi enhancer trap Philippe transgenik sinek hattı oluşturarak ve her hattaki lipazın MSS ekspresyon paternini belirleyerek gerçekleştirilir. Bir GFP raporlayıcısı kullanılarak, IMMUNOCHEMISTRY ve GFP raporları, ilgilenilen ET flip hatlarında GAL4 ekspresyonunu kesiştirmek için glial ekspresyonu nöronal ekspresyondan ayırabilir ve progenide GAL 80 dönüştürme aracı içeren sinekleri belirleyebilir.

Klonal analiz, gözde olduğu gibi GAL4 ekspresyonunun rafine edilmesini analiz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, geliştirici izleme tabanlı hatların GAL80 dönüştürme araçlarıyla birlikte, sinek topluluğunda halihazırda mevcut olan geniş bir GAL4 koleksiyonuyla hızlı bir şekilde kullanılabilmesidir. Ayrıca bu konsept, zebrafish gibi diğer GAL4 UAS tabanlı model organizmalara da genişletilebilir.

Bu yöntem, davranışın temelini oluşturan nöral devrelerin haritalanmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokol, fotoreseptör hücrelerin bir alt kümesinde flip bazının kullanımını göstermesine rağmen, kesişimsel yöntem nöronal olmayan dokular da dahil olmak üzere diğer dokuların analizine uygulanabilir. Daha fazla enhancer trap lipase hatı karakterize edildikçe.

GAL4 sistemi, sinek biyologları tarafından yaygın olarak kullanılan önemli bir tekniktir. Çoğu GAL4 hattının bir dezavantajı, FLP-out yöntemleri kullanılarak beyin davranış haritalaması yapmak için fazla geniş çaplı ifade edilmeleridir. Bir FXR flip transgeni kullanarak GAL4 ekspresyon hatlarının ifadesini kısmen kısıtlamadan önce, ilgilenilen hücrelerde GAL4 ifadesini hassas bir şekilde ayarlamak mümkün değildir.

Öncelikle, CNS'deki flip a ekspresyonunu görselleştirmek için, gelişimin geç evresindeki larvalarda ve yetişkinlerde ET flip x two transgeninin ekspresyon paternini bilmek faydalıdır. İlgili ET t flip X two transgenine sahip erkekler ile et flip ekspresyonu için A GFP reporter taşıyan bakire dişiler arasında bir çaprazlama gerçekleştirin. Diseksiyon için gezgin üçüncü instar F1 larvalarını toplayın. Larvaları temiz bir S guard kabına yerleştirin, bir boya fırçasıyla tüm kalıntıları temizleyin ve kabı bir kez 1x PBS ile durulayın.

Şimdi, larvaları anestezi altına almak için tabağı buz gibi 1x PBS ile doldurun; bir larvanın merkezi sinir sistemine (CNS) erişmek için ağız kancasını bir pens yardımıyla tutun. Uzanan anterior kürenin yakınındaki kütikülü kavrayın ve geriye doğru soyun. CNS, diğer bazı yapılarla birlikte ağız kancasına bağlı kalacaktır.

Şimdi, merkezi sinir sistemini (CNS) diseke ederken, çevresindeki tüm fazla yapıları bir penset yardımıyla çıkarın. Bunları tek tek PBS ile doldurulmuş üç bölmeli bir Pyrex kaba aktarın. Tüm CNS yapıları diseke edildikten sonra, buz üzerinde 200 µL %4 PFA içine tamamen daldırarak sabitleyin.

Eğer bir MSS yüzüyorsa, çevresindeki tüm dokulardan tamamen temizlenmemiş demektir. Böyle bir durum oluşursa, bir pens yardımıyla MSS'yi tekrar fiksatife daldırıp 15 dakika boyunca fikse edin, dokuyu buz gibi soğuk PBS ile 3 kez yıkayın ve ardından dokuyu buz gibi soğuk PBT ile üç kez daha yıkayın. Doku artık görüntülenmeye, antikorlarla işaretlenmeye veya daha sonra kullanılmak üzere dört derece Celsius'ta PBT içinde saklanmaya hazırdır.

Larvaların elde edildiği aynı çaprazlamadan, diseksiyon öncesinde F1 adultlar toplandı. Kütikül yüzeyindeki mum tabakasını uzaklaştırmak için beş ila 10 sinek, 30 saniye boyunca soğutulmuş %95 etanolde bekletildi. Etanolü uzaklaştırmak için adultlar, buz soğukluğundaki 1x PBS ile üç kez yıkandı ve üçüncü yıkamadan sonra, diseksiyona hazırlamak amacıyla adultlardan biri buz soğukluğunda 1x PBS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir sil guard kaba aktarıldı.

Ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve karnın orta kısmına bir minion pini saplayın. Bacakları çıkarmak için penset kullanarak disseksiyona başlayın. Ardından, başı desteklere sabitleyerek ve eş zamanlı olarak kütikülü gözün altından başın üst kısmına doğru soyarak baş kütikülünü çıkarın.

Sivri uçlu pensleri dikkatlice kullanarak, beyni çevreleyen trake dokularını çıkarın; çünkü trake dokuları güçlü otofloresans özelliğine sahiptir ve tespit işlemi sırasında beynin yüzmesine neden olur. Beyin, yetişkin merkezi sinir sisteminin (CNS) sadece bir parçasıdır. Diğer parça ise toraksta bulunan ventral sinir kordonu veya VNC'dir ve bunun da diseke edilmesi gerekir.

İlk olarak, sineği arka bacağın tabanından sabitleyerek ve torasik kütikülü boyun tabanına kadar nazikçe çekerek çıkarın. İkinci olarak, VNC'yi açığa çıkarmak için torasik kütikülün iki yarısını nazikçe ayırın. Üçüncü olarak, ikinci bacağın tabanından sabitleyerek ve karnı ilk abdominal segmentin yakınından çekerek, abdomeni torakstan ayırın.

Dördüncü olarak, humeral bölgeden sabitleyerek ve VNC'yi çevreleyen dokuyu nazikçe yırtarak VNC'yi temizleyin. Servikal bağ dokuyu çevreleyen bağ doku halkasını ayırın ve beyni toplarken fazla dokuları çıkarmaya devam edin. Ardından, beyin ve VNC'yi çiftler halinde, buz üzerinde tutulan soğutulmuş 1x PBS ile dolu dokuz kuyucuklu bir Pyrex kaba aktarın.

Yetişkin dokuları tespit etmek için, dokuları buz üzerinde %4 PFA içerisinde 15 dakika bekletin. Ardından dokuları üç kez buz gibi soğuk PBS ile ve üç kez PBT ile yıkayın. Dokular artık, transgen ekspresyonunu doğrulukla analiz etmek amacıyla görüntülenmeye veya antikorlarla işaretlenmeye hazırdır.

Bir referans çerçevesi sağlamak için MSS'nin nöronal veya glial belirteçlerle işaretlenmesi faydalıdır; işleme, dokuyu gece boyunca dört derece Celsius'ta nöronlara veya glia hücrelerine karşı antikorlarla inkübe ederek başlayın. Ertesi gün, preparatı beş kez PBT ile yıkayın ve floresan ikincil antikorla oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, antikorun fotobeyazlamasını önlemek için plakayı folyo ile sarın.

Preparatı PBS ile yıkayın ve preparatı bir lam üzerine bütün halde monte edin. Dokunun lameli tarafından ezilmesini önlemek için bir OSHA plastik halkası kullanın. Sinir sistemi artık floresan mikroskobu altında GFP ve LL ekspresyon paternleri açısından incelenmeye hazırdır.

Flip ekspresyon paterninin tekrarlanabilirliğini belirlemek için genellikle üç ila beş replikat incelenir. Flip, bir hattaki flip ekspresyon paterni, GAL 4 represörü GAL 80'in nasıl eksprese edildiğini değiştirmek için diğer transgenlerle birlikte kullanılabilir. GAL 80 represör ekspresyonunu değiştirmek, değişiklikler yapmak için etkili bir yöntemdir.

GAL4 ekspresyonunda kullanılan yöntemlerden biri, gözün genelinde dejenerasyonu tetikleyen GAL4'ü inaktive eden transgen GAL80 ekspresyonunun flip-out yöntemiyle dışarı çıkarılmasıdır. Burada, F1 dölündeki fotoreseptörlerin bir alt kümesinde GAL80 dönüştürme aracının etkinliğini değerlendirmek ve göz fenotipini ebeveyn suşların göz fenotipiyle karşılaştırmak için ET flip hattı hs688A kullanılmıştır. Göz deformasyonu veya depigmentasyonun görülmesi, flip ekspresyon paterninin fotoreseptörlerde mevcut olduğunu ve GAL80 flip-out işleminin başarılı olduğunu doğrular.

Tamamlayıcı ve tekrarlayan olmayan bir strateji, ilgi duyulan aynı flip hattını kullanarak GAL 80 ekspresyonunu flip ile içeri aktarmaktır. Bu strateji diğerine çok benzer, ancak bu durumda F1 dölündeki ID pigmentasyonu ve dejenerasyonu baskılanır. Flip X iki'de.

Fotoreseptörlerin ekspresyonu. MSS diseksiyonu konusunda uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse yetişkinler için yaklaşık beş dakikada ve larvalar için bir dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hem yetişkinlerde hem de Libre C ve Ss'lerde trakeanın ve çevredeki dokuların temizlenmesi için keskin pensler kullanılması önemlidir. Diseksiyon için fiksatif içermeyen bir kap kullanılması önemlidir. Rastgele klonlar oluşturmak için şu anda ısı şoku flip yöntemi kullanılmaktadır.

Buna karşılık, enhancer trap flip yöntemi, morfolojik ve davranışsal analizleri kolaylaştırarak tekrarlanabilir klonların üretilmesine olanak tanır. Finger yönteminin bir diğer güçlü yönü, ek enhancer trap flip tabanlı hatlar ve diğer gal hatları kullanılarak GAL4 ekspresyon modellerinin daha da kısıtlanabilmesidir. Tubulin stop GAL80 konfigürasyonunun bir zayıf yönü ise, LAG4 ve UAS-Kir gibi bazı GAL4 ve UAS efektör kombinasyonlarının, sinekleri öldüreceği için uyumlu olmamasıdır.

Bu sorun, bir davranışın kısıtlayıcı sıcaklıklarda beklendiği gibi incelenmesine olanak tanıyan UAS Shiri Ts gibi koşullu bir UAS efektörü kullanılarak kolayca aşılabilir. Tüm enhancer trap lipaz hatları, faydalı olacak kadar yüksek düzeyde lipaz ekspres etmeyecektir. Buna rağmen, burada açıklanan parmak tekniği, drosophila araştırmacılarına gelişim devreleri veya davranış için mozaik analizi geliştirme konusunda yeni bir yaklaşım sunmaktadır.