Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, kültür ortamında morfolojik ve fizyolojik olarak doğal akciğer dokusu ile karşılaştırılabilir akciğer dokusu üretmektir. Bu işlem, öncelikle yetişkin bir sıçandan kalp ve akciğerlerin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, pulmoner arterin ve trakeanın kanüle edilmesi ve kanüle edilen akciğerlerin deselülarizasyon için bir biyoreaktöre bağlanmasıdır.

Deselülarizasyon ve durulama işlemleri sonrası akciğer, steril bir kültür biyoreaktörüne aktarılır ve ekime hazırlanır. Prosedürün son adımı, akciğerin istenen kompartmanının hazırlanmış bir hücre popülasyonu ile ekilmesidir. Nihayetinde, immünofloresans mikroskopisi aracılığıyla deselülarize ekstrasellüler matrisin, bölgeye özgü akciğer markerlarını eksprese eden hücrelerle verimli bir şekilde yeniden popüle edildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, akciğer hücrelerini in vitro kültürleme yöntemlerine göre temel avantajı, hücrelerin farklılaşmış fenotiplerini uzun bir süre boyunca korumalarıdır; böylece hücreler, biyolojik kaynaklı üç boyutlu bir substrat içinde birkaç hafta boyunca incelenebilir. Deselülarizasyon için akciğerler, vasküler kanül aracılığıyla biyoreaktör kapağına bağlanır ve kap da deselülarizasyon düzeneğine bağlanır. Akciğerlerin üzerindeki cam şişe, bir ring stand ve bağlı bir kıskaç ile sabitlenir.

Bu noktada, hücresel materyal uzaklaştırılarak, yeniden hücresel materyalle doldurulabilecek bir hücre dışı matris iskeleti üretilebilir. Mühendislik ürünü akciğer dokusunun ekimi ve kültürü için biyoreaktörün kurulumu bu diyagramda gösterilmiştir. Trakeal kanülün lure lock konnektörü, trake rezervuarı ile ana hazne arasındaki bir solunum döngüsüne bağlanır.

Solunum döngüsü iki adet tek yönlü valf içerir. Bu valfler, ortamın akciğere girerken ve akciğerden çıkarken farklı yolları izleyeceği şekilde konumlandırılmıştır. Endotel hücrelerinin ekimi için perfüzyon hattına geçici olarak küçük bir rezervuar dahil edilmiştir.

Hücreleri rezervuardan akciğerin vasküler bölmesine aktarmak için pulsatil bir pompa kullanılır. Vasküler perfüzyon, bir roller pompa kullanılarak sağlanır. Besiyeri, takılı kanül aracılığıyla pulmoner artere perfüze edilir, akciğer vaskülatürü boyunca akar ve pulmoner venden doğrudan, besiyerinin perfüzyon için geri çekildiği ana biyoreaktöre geçer.

Akciğer epiteli, solunum döngüsüne enjeksiyon yoluyla yerleştirilir. Akciğeri içeren ana hazne ve trake rezervuarı, uzun süreli akciğer kültürü için kullanılır. Akciğerler çıkarıldıktan ve arter ile trake doğru şekilde kanüle edildikten sonra, yeni çıkarılan akciğerler hava sızdırmadan havayı tutmalıdır.

Bu durum, sıvıya daldırılmış haldeyken hava ile şişirilerek doğrulanabilir. Hava sızıntısına işaret eden herhangi bir kabarcık oluşmamalıdır. Protokole başlamak için, akciğerler tam dolana kadar ancak aşırı şişirilmeyecek şekilde sodyum nitroprusid içeren PBS ile şişirilir ve akciğerlerin şişmiş halde kalması için trakeal kanül hemen kapatılır.

Ardından, akciğerleri en az 15 dakika boyunca 15 mmHg basınçta PBS ve SNP ile perfüze edin. Bundan sonra, akciğerlerin sönmesine izin vermek için trakeal kanülün tıpasını çıkarın. Gerekirse PBS ve SNP ile perfüzyona 15 ila 30 dakika daha devam edin.

Perfüzyon basıncının 10 ila 15 mmHg seviyesinde tutulduğundan emin olmak için PBS ve SNP takviyesi yapın. Uzun süreli desellülarizasyon prosedürüne başlamak için biyoreaktör kapağı desellülarizasyon düzeneğine bağlanır. Ardından akciğerler kapağa bağlanır.

Y şeklinde kanüle bağlı luer lock bağlantıları kullanılarak, pulmoner arter kanülü perfüzyon hattına bağlanmalı ve trakeal kanül serbestçe durmalıdır. Dokunun tam olarak deselülerizasyonunu sağlamak için sisteme hava girmesini önlemek kritik önem taşır. Arteriyel ve trakeal kanüldeki tek yönlü valfler, tüp içinde ters akışa izin vererek tüplerdeki hava kabarcıklarının temizlenmesine yardımcı olur.

Bu nedenle, hava kabarcıklarının şırınga ile uzaklaştırılmasını sağlayarak tüm hatların havadan arındırıldığından emin olun. Deselülarizasyon solüsyonu ile perfüzyona başlayın. Deselülarizasyon solüsyonu ile perfüze edin.

Akciğerlerden 500 mililitre çözelti perfüze edilene kadar, optimal basınç 15 milimetre cıva'dan düşük olmalıdır. Bu işlem tipik olarak 2,5 saat sürer. Akış hızları başlangıçta genellikle çok yavaştır ve ikinci saat sırasında hızla artırılarak dakikada yaklaşık bir mililitre veya daha fazlasına çıkarılır.

Perfüzyon sırasında, akciğer ve trakeal kanülü destekleyecek kadar sıvı kaldığından emin olarak, kullanılmış deselülarizasyon sıvısını biyoreaktörden periyodik olarak uzaklaştırın. Deselülarizasyon sıvısı ile perfüzyon tamamlandığında, akciğerleri ve biyoreaktörü bir doku kültürü kabinine aktarın. Organ durulamasına başlamak için, deselülarizasyon sıvısını içeren 500 mililitrelik kavanozu çıkarın ve yerine bir litreye kadar steril PBS içeren steril bir kavanoz yerleştirin.

Hatların havadan arındırıldığından emin olmak için vakum emişi veya bir şırınga kullanın; PBS'yi damar sisteminden benzer şekilde 10 ila 15 mmHg basınçla perfüze edin. Deselülarizasyonda olduğu gibi, steril teknikler kullanarak biyoreaktördeki atık PBS'yi periyodik olarak uzaklaştırın ve PBS kavanozunu değiştirin veya yeniden doldurun. Akciğerlerden en az 2.5 L steril PBS perfüze olana kadar taze, steril PBS ile durulamaya devam edin.

Bu işlem, durulama tamamlandığında deselülarizasyon sürecinin başlangıcından itibaren genellikle iki gün sürer. Akciğerleri, taze PBS artı %10 FBS artı %10 Pen strep içeren yeni bir steril biyoreaktör sistemine aktarın; hem tüm perfüzyon döngüsünün hem de tüm hava yolu hatlarının sıvı ile dolu olduğundan emin olun. Bu aşamadan itibaren, akciğerleri dakikada beş milimetre hızla perfüze etmek için pulsatil bir pompa kullanılacaktır.

Akciğer hücre dışı matris iskelelerini, %10 FBS ve %10 penisilin streptomisin içeren PBS ile gece boyunca perfüzyon yaparak sterilize edin. Bu adım tamamlandıktan sonra, akciğerleri bir saat boyunca veya sıcaklık dengelenene kadar 37 degree Celsius'lik bir inkübatöre aktarın. Ben Nase tedavisine hazırlık için bir sonraki adım, akciğerlerin Ben Nase ile işlenmesidir.

Her bir akciğerdeki kalıntı DNA'yı uzaklaştırmak için, önce bir 10 milliliter şırıngayı sadece önceden ısıtılmış Ben Nase tamponuyla, diğer bir 10 milliliter şırıngayı ise Ben Nase tamponu içinde seyreltilmiş 90 units per milliliter Ben Nase ile doldurun. Akciğerlerin perfüzyonunu durdurun.

Ardından, akciğerlere hava enjekte etmekten kaçınarak solunum yolunu Ben Nase tamponu ile şişirin. Akciğerin bir dakika boyunca sönmesine izin verin. Daha sonra akciğeri Ben Nase çözeltisi ile şişirin.

Ben Nase ile şişirdikten sonra akciğere hava kaçırmamaya tekrar dikkat edin. Akciğerlerin 37 °C'de, perfüzyon veya ventilasyon uygulanmadan bir saat boyunca bekletilmesine izin verin. Bir saatin sonunda, biyoreaktörde halihazırda bulunan PBS artı %10 FBS %10 penisilin streptomisin ile perfüzyona yeniden başlayın ve perfüzyonu ertesi güne kadar gece boyunca sürdürün.

Durulama ve sterilizasyon işlemlerinin ardından, uzun hücre dışı matris iskelesi hücresel yeniden popülasyon için hazırlanabilir. P-B-S-F-B-S benzo a çözeltisini 250 mililitre kültür ortamı ile değiştirin. Hücreler eklenmeden önce en az bir saat boyunca perfüzyon uygulayın ve hücre ekiminden hemen önce taze kültür ortamı ile değiştirin.

Organ yeniden yapılandırma için birçok hücre kaynağı kullanılabilir. Burada, epitel hücre popülasyonu ile ekim işlemi gösterilecektir. Öncelikle, istenen epitel hücre popülasyonunun 15 mililitre hücre süspansiyonunu içeren bir şırınga hazırlayın.

Ardından, hava yolu rezervuarını 80 milliliters kültür ortamı ile doldurun ve tüm ventilasyon hatlarının havadan arındırıldığından emin olun. Daha sonra biyoreaktörü 37 degrees Celsius bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve ventilasyon için şırınga pompasını bağlayın. 15 milliliter hücre süspansiyonunu trakeal kanüle enjekte ederek, tek bir hızlı bolus şeklinde hücreleri akciğerlere ekleyin.

Ana biyoreaktördeki hava filtrelerinin kapalı olduğundan emin olun. Ardından, şırınga pompasını kullanarak ana biyoreaktörden dakikada 3 mililitre hızla 60 mililitre hava çekecek şekilde tek bir yavaş nefes alma işlemine hemen başlayın. Bu işlem yaklaşık 20 dakika sürecektir.

Bundan sonra akciğerlerin yaklaşık 18 saat boyunca statik durumda kalmasına izin verin. Yaklaşık 0,5 milliliters per minute hızında yavaş vasküler perfüzyona başlayın. Organ kültürü sırasında perfüzyon tipik olarak one to three milliliters per minute hızında gerçekleştirilir.

Epitel kültürü sırasında bir roller pompa kullanıldığında, ventilasyon tipik olarak dakikada bir soluk hızında ve 5 ila 10 ml tidal hacimde sürekli olarak sağlanır. Bir şırınga pompası kullanıldığında, ana oda içerisindeki negatif basınç ve atmosferik basınç arasında geçiş yaparak solunumu gerçekleştirmek için hava, biyoreaktöre döngüsel olarak çekilir ve enjekte edilir. Ventilasyon sırasında biyoreaktörün hava sızdırmazlığının korunması gerektiğinden, ventilasyona her gün ara verilmeli ve ana odadaki hava değiştirilmelidir.

Ek olarak, besiyeri yaklaşık her üç ila dört günde bir değiştirilmelidir. Kültür süresince, pulmoner epitel ve vasküler endotel kültüre edilerek, her seferinde toplam hacmin yaklaşık yarısı yenilenmelidir. Biyoreaktöre monte edilmiş iskele içerisinde, kısa zaman aralıkları boyunca gaz değişimine katılabilen akciğer dokusu üretmekteyiz.

Dekalsifiye edilmiş sıçan akciğerinin H ve E boyamasıyla karşılaştırmak amacıyla, doğal sıçan akciğerinin standart hematoksilin ve eozin boyaması burada gösterilmiştir. Nihai dekalsifiye ekstraselüler matris, hücresel materyallerden tamamen arınmış olmalı ve doğal akciğerin makroskobik, mikroskobik ve ultrastrüktürel özelliklerini korumalıdır. H ve E boyaması, yetersiz dekalsifikasyon veya durulama sonucunda iskelete yapışmış olan kalıntı DNA'ların görselleştirilmesini sağlayarak, hücre ekimi ve akciğerin sonraki kültürü için optimal koşulların belirlenmesine imkan tanıyacaktır.

Biyoreaktör, akciğerin her beş lobunda da iyi dağılmış hücreler sağlamalı ve hücre dışı matris iskelenin yaklaşık %70'ini kaplamalıdır. Bu görüntüler, immünofloresan boyama yapıldığında doğal akciğer ile yeniden popüle edilmiş akciğeri karşılaştırmaktadır. Temel akciğer markörleri açısından, kültüre edilen hücre popülasyonu Clara hücresi salgılayıcı proteini pro salgılayıcı protein C ve Aquaporin beş için pozitiftir.

Tüm panellerde ilgi duyulan markerlar kırmızı ile ve DAPI ile boyanmış çekirdekler mavi ile gösterilmiştir. Desellülarizasyondan geri çekilmeye kadar olan bu prosedür, bir kez ustalaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında dört ila beş gün içinde tamamlanabilir.