Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde kardiyomiyosit diferansiyasyonu için gerekli olan kritik zamansal düzenlemeyi belirlemektir. Bu, ikinci bir adım olarak EB oluşumunu standardize etmek için öncelikle 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plaka içinde embriyonik gövdeler oluşturularak gerçekleştirilir. Protein veya kimyasal modülatörler, önceden belirlenmiş bir zaman çizelgesi boyunca EB'lere eklenir; bu da incelenen yolakların zamansal kontrolüne olanak tanır.

Ardından, çeşitli sinyal modülasyon şemalarının indüksiyon verimliliğini belirlemek için atan EBS'ler manuel olarak sayılır. Oluşan atan EBS yüzdesi ve asma damla yöntemi kullanılarak yapılan doğrulama ile, kardiyomiyosit farklılaşması için temel sinyal yollarının zamansal gereksinimlerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin asma damla gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, emek yoğun bir prosedürü standart hale getirip basitleştirmesi ve niceliksel belirleme için doğrudan bir okuma imkanı sunmasıdır.

Bu yöntem, farklılaşmayı istenen hücre tipine yönlendiren temel sinyal koagülasyonlarının belirlenmesi gibi, kök hücre biyolojisi alanındaki kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, fare embriyonik kök hücrelerini, lösemi inhibitör faktörü ile desteklenmiş fare ES hücresi ortamı içeren 10 santimetrelik hücre kültürü plaklarında büyütün. ES hücreleri %50 ila %70 konfluansa ulaştığında, kullanıma hazır hale gelirler.

ES medyumunu uzaklaştırın ve hücreleri beş mililitre steril PBS ile bir kez yıkayın. Her plağa iki mililitre %0,05 tripsin EDTA ekleyin ve plakları 37 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, plak başına üç mililitre ES medyumu ile tripsin EDTA'yı nötralize edin ve hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Dakikada 1000 devirde üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini istenen miktarda EB besiyeri ile yeniden süspande edin. Hücre sayısını belirleyin ve ardından hücreleri mililitre başına 5 × 10³ hücre olacak şekilde dilüe edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre içeren 100 µL EB medyumunu 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir mikrotitrasyon plakasının her bir kuyucuğuna ekleyin. Gereken 96 kuyucuklu plaka sayısı, deneydeki koşulların ve zaman noktalarının sayısına bağlı olarak değişecektir. Kardiyogenez için temel sinyal yolaklarının kritik zaman pencerelerini belirlemek amacıyla, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı mikrotitrasyon plakalarını nemlendirilmiş 37 °C %5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.

Belirli sinyal yolaklarının modülatörleri ES hücrelerine eklenir. 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakaların her bir kuyucuğuna, çeşitli zaman noktalarında besiyerinde seyreltilmiş sinyal modülatörü eklenir. Her bir 96 kuyucuklu plaktaki kuyucukların yarısı, her bir başlangıç tedavi zaman noktası için kullanılır.

Her zaman noktası için diğer 48 kuyucuğa bir araç kontrolü eklenir. Farklı durdurma noktalarında, medyayı değiştirerek her kuyucuktaki sinyal modülatörlerini yıkayacağız ve bunu yaparken embriyonik gövdelerin bozulmasını önlemek için büyük özen gösterilmelidir. Farklı durdurma zaman noktalarında, kuyucuklar için EB medyasını değiştirerek modülatörleri yıkayın. 96 kuyucuklu plakayı yaklaşık 10 derecelik bir açıyla eğin ve bir çok kanallı pipet ile medyayı kuyucuktan nazikçe alın.

Ardından, 48 saatten uzun süren tüm işlemler için her kuyucuğa modülatör içermeyen EB medyumu ekleyin. İstenen durdurma zamanına kadar, taze modülatörlerle desteklenmiş EB medyumunu iki günde bir değiştirin. ES hücrelerinin 96 kuyucuklu plakalara aktarılmasıyla EB'lerin indüklendiği tarihten yedi gün sonra, EB kontraksiyonunu bir mikroskop altında inceleyin.

Her bir farklı işlem zaman seyri için kasılan EBS yüzdelerini elde etmek amacıyla, kasılan EBS içeren kuyucukları pozitif olarak puanlayın. 96 kuyucuklu plaka deneyleri ile belirlenen kardiyojenez sinyal zaman pencereleri, asılı damlalar şeklinde hazırlanan EBS'lerde doğrulanabilir. Öncelikle, damlacıkların daha sonra bozulmasını önlemek için Petri kaplarına üç ila dört mililitre PBS ekleyerek hazırlık yapın.

Ardından, final yoğunluğu 2,5 x 10⁴ hücre/mL olacak şekilde hazırlanan bir ES hücre süspansiyonu, kolay erişim için bir bakteri kabına dökülür. Çok kanallı bir pipet kullanarak, Petri kaplarının ters çevrilmiş kapaklarına 20 µL'lik ES hücresi damlacıkları ekleyin. Münferit damlacıkların birbirine temas etmesine izin vermeyin.

Genellikle, bir kapak 80 damlaya kadar kapasiteye sahiptir. Ardından, kapağı PBS içeren Petri kabının üzerine ters çevirin ve EB oluşumu için 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 48 saat bekletin. 48 saat sonra, her kapağın asılı damlalarından oluşan EB'leri üç mililitre EB medyası ile yıkayarak toplayın.

İki EBS kapağını yeni bir Petri kabına alın. Petri kabını 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde dört gün boyunca inkübe edin. Dördüncü günde, süspansiyon halindeki EBS'leri genel olarak %0,2 Jelatin kaplı altı kuyucuklu plakalara aktarın. Her kuyucuğa 30 EBS aktarın; sinyal modülatörlerini, 96 kuyucuklu plaka deneylerinden belirlenen zaman diliminde, asılı damlacıklar oluşturulduktan yedi gün sonra inkübe edin.

EB kasılmasını gözlemlemek için EBS'leri mikroskop altında inceleyin; 96 kuyucuklu bir plakanın yuvarlak dipli kuyucuklarında büyütülen ES hücreleri, dördüncü günde oluşmuş bir EB'yi gösteren bu temsilci görüntüde olduğu gibi EBS'ler oluşturacaktır. ES kardiyogenezi için kritik zaman noktaları, araç kontrolü ile karşılaştırıldığında, sinyal modülatörleri ile tedavi edilmiş kasılan EBS'lerin en yüksek yüzdesini içeren zaman pencereleridir. Burada, 96 kuyucuklu bir mikrotitr plakasında, farklılaşmanın 10. gününde dorsal morfin ile tedavi edilmiş ES hücrelerinden oluşmuş, kendiliğinden kasılan bir kardiyomiyosit odağı gösterilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, ES kardiyogenezindeki temel sinyal yolaklarının kritik zamansal düzenleme pencerelerinin nasıl verimli bir şekilde belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.