Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

Bu prosedürün genel amacı, toprak veya gübre örneği ekstraktlarındaki enzimle hidrolize olan organik fosforu sınıflandırmaktır. Bu işlem, öncelikle örneklerin sodyum hidroksit EDTA çözeltisi ile ekstrakte edilmesi ve ekstraktların pH değerinin ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, pH'ı ayarlanmış bu ekstraktlar iki farklı enzim çözeltisi ile inkübe edilir.

96 kuyucuklu bir plakada son adım, enzim tarafından serbest bırakılan ortofosfatın molibden mavisi kolorimetrisi kullanılarak ölçülmesidir. Nihayetinde, toprak veya gübre numunelerindeki çoğu doğal ortofosfat mono ester fosfor ve diester fosfor formları, enzim hidroliz yöntemiyle ortofosfatın farklılaşan salınımı baz alınarak sınıflandırılabilir. Bu yöntem, herhangi bir standart laboratuvarda düşük maliyetle gerçekleştirilebilir.

Fosfor 31 nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre sahip olduğu temel avantaj, doğal toprak enzimlerinin gelecekte organik bezelye bileşiklerinden ortofosfat salma potansiyelini ölçebilmesidir. Bu nedenle, bu yöntemle elde edilen veriler toprak verimliliğinin veya toprağın algler tarafından kullanılabilir miktarlarda zararlı ortofosfat salma potansiyelinin tahmin edilmesine yardımcı olabilir. 50 mililitrelik konik tüp içerisindeki iki gram yaş veya kurutulmuş numuneye, 0.25 molar sodyum hidroksit çözeltisinden 30 mililitre ekleyin.

Oda sıcaklığında 16 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin. Örnekleri 3000 ×g'de 30 dakika santrifüjleyin, ardından 100 µL'yi halihazırda asetat tamponu içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ayarlanmış örneğin toplam hacmi 1 mL ve pH değeri 5.0'dir.

Taze hazırlanmış 10 mililitre 0.1 molar sodyum asetat pH 5 içerisinde mililitre başına 0.5 ünite asid fosfataz içeren iki stok çözelti hazırlayın. Şimdi, asid fosfataz stoklarının bulunduğu 10 mililitrelik tüplerden birine, mililitre başına 2.5 ünite NP1 nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde Penicillium Citron'dan yeniden konstitüe edilmiş liyofilize nükleaz NP1 ekleyin ve birkaç kez ters çevirerek nazikçe karıştırın; iki enzim çözeltisini 3000 ×g'de 30 dakika santrifüjleyin. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 1 mililitre 1 milimolar potasyum fosfat stok çözeltisi ekleyerek başlayın ve yedi adet 0.5 mililitrelik seri dilüsyon gerçekleştirin; nihai dilüsyon aralığı 20 µM ile 0.625 µM fosfor arasında olacak şekilde ilk tüpü atın.

Şimdi ORTOFOSFAT standartlarını plakadaki son iki sütuna aktarın; A satırındaki sıfır NM ortofosfat ile başlayarak 10. sütunun ilk üç kuyucuğuna kadar H satırındaki 20 nm ortofosfat ile bitirin. 10. sütunun sonraki üç kuyucuğuna 40 mikrolitre PP artı GP enzim solüsyonu ekleyin. 40 mikrolitre PP artı GP artı NP tek enzim solüsyonu ekleyin.

Son olarak, altı kuyucuğun tamamına 40 µL 100 mM asetat tamponu ekleyin. Şu anda 10. sütundaki ilk altı kuyucuğun her biri 80 µL çözelti içermelidir; sonraki iki kuyucuğa geçin. 10 M glukoz ve altı fosfat içeren 40 µL sodyum asetat çözeltisi ile 40 µL PP artı GP enzim çözeltisi ekleyin.

Test edilen her bir örnek için, tüm örneklerin dağıtımı tamamlandıktan sonra pH'ı ayarlanmış 40 µL örnek ekstraktını sekiz sıraya kadar olan bir ila dokuz numaralı kuyucuklara dağıtın. Çok kanallı bir pipet kullanarak bir ila üç numaralı sütunlara PP artı GP enzim çözeltisini, dört ila altı numaralı sütunlara PP artı GP artı NP 1'i ve yedi ila dokuz numaralı sütunlara 0.1 M sodyum asetat tamponu dağıtın. Tüm örneklerin eşdeğer inkübasyon süresi almasını sağlamak için bu adımı hızlıca gerçekleştirin.

96 kuyucuklu plakayı bir kapakla kapatın ve numuneleri, enzim çözeltilerini, kontrolleri ve kalibrasyon eğrisini deiyonize su içerisinde 37 °C'de tam bir saat inkübe edin. Dört stok çözeltinin her birinden 50 mL hazırlayın. A çözeltisi, çok kanallı bir pipet kullanılarak her gün hızlıca hazırlanmalıdır.

96 kuyucuklu plakadaki tüm kuyucuklara 25 µL SDS, 100 µL solüsyon a, 20 µL solüsyon B ve 50 µL solüsyon C ekleyin. Plağın kapağını kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, herhangi bir ayarlanabilir mikroplaka okuyucu kullanarak 850 nm'de absorbansı ölçün ve verileri bir hesap tablosu uygulamasına kaydedin.

İlk olarak, x ekseninde 0 ila 20 nanomol fosfor ve Y ekseninde duble absorbans ölçümlerinin ortalaması olacak şekilde inorganik fosfor kalibrasyon eğrisini çizin, doğrusal regresyon gerçekleştirin ve en iyi uyum doğrusunun denklemini bulun. Ardından, birinci ile üçüncü sütunlardaki değerlerin ortalamasını alarak ve ardından kalibrasyon eğrisini veri setine uygulayarak arka plan inorganik fosforu hesaplayın. Son olarak, hidrolize fosfor mono esterlerinden kaynaklanan fosforu belirlemek için dördüncü ile altıncı sütunlardaki triplike örnek değerlerinin ortalamasını alın ve kontrol enzim çözeltisi ile arka plan inorganik fosfor miktarını çıkarın.

Ardından, hidrolize fosfor üzerinden fosfor içeriğini hesaplamak için, DER'ler yedi ile dokuzuncu sütunlar arasındaki üç tekrarlı örnek değerlerinin ortalamasını alır ve dördüncü ile altıncı sütunlardaki kontrol enzim çözeltisi ile arka plan inorganik fosfor ve hidrolize mono ester fosfor toplamını bu değerden çıkarır. Tipik bir 96 kuyucuklu plaka, sekiz örneğe ait sonuçları ve bir kalibrasyon eğrisini gösterir. Kontroller 10. sütundadır.

Birinci ile üçüncü sütunlar ile dördüncü ile altıncı sütunlar arasındaki renk yoğunluğu artışı, hidrolizelemiş mono ester fosfor bileşiklerinden kaynaklanmaktadır; dördüncü ile altıncı sütunlar ile yedinci ve dokuzuncu sütunlar arasındaki artış ise hidrolizelemiş di ester fosfor bileşiklerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bir Vermont toprak örneğinin 0,25 molar sodyum hidroksit ve 0,05 molar EDTA ekstraktlarındaki fosfor sınıflarının dağılımını başarıyla analiz etmek için yüksek throughput enzimatik hidroliz yöntemi kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, enzimatik hidroliz kullanarak toprak veya gübre ekstraktlarındaki doğal ortofosfat, mono ester ve di ester fosfor bileşiklerinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknik, çevre kimyası ve besin yönetimi alanındaki araştırmacıların toprak veya gübre sistemlerindeki organik P davranışını incelemelerine yardımcı olabilir.