Hücre hücre Etkileşim kurgulama için Silikon mikroçipler

Merhaba, ben Elliot Hu. Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'ndeki Tia'nın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün silikon mikromekanik çipler üzerinde hücre kültürleri hazırlayacağız. Cihazlar birbirine kilitlenen küçük taraklara benziyor ve iki farklı hücre popülasyonu arasındaki etkileşimleri hassas bir şekilde manipüle etmemize olanak tanıyorlar.

Bugün karaciğer hepatositleri ile destekleyici stromal hücreler arasındaki etkileşimi inceleyeceğiz. Özellikle, 3T3 fibroblast hücreleri tarakların üst yüzeyine kültüre edilmiştir; böylece tarak dişlerini kaydırarak hücreleri hareket ettirebilir ve mekansal düzenlerini değiştirebilirsiniz. Her bir cihaz, iki olası konfigürasyonda birbirine kenetlenen iki parçaya ayrılmıştır.

İlki, iki hücre popülasyonunu birbiriyle temas ettirir. İkincisi ise, hücrelerin birbirine dokunamaması için iki popülasyonu hafifçe ayırır. Burada, temas etkileşimleri engellenirken, salgılanan faktörler aracılığıyla gerçekleşen etkileşimler korunur.

Parçaların cımbızla nasıl tutulacağıyla konuşmaya başlayalım. Hem daha büyük Teflon cımbızları hem de daha küçük yuvarlak uçlu metal cımbızları kullanmayı tercih ediyorum. Büyük cımbızlarla, parçaları kenarlarından bu şekilde tutabilirsiniz; kolları olan daha büyük parçalarda, kollar çok kırılgan olduğu için onları kırmamaya dikkat etmeniz gerekir.

Parçaları şu şekilde arka kısımlarından tutmak istersiniz. Metal penset ile deliğin içine ulaşıp chipleri doğrudan alabilirsiniz. Daha büyük parçalar 12 kuyucuklu bir plaka duvarına sığacakken, daha küçük parçalar ya 24 kuyucuklu bir plakaya sığar ya da büyük parçayla eşleştirilebilir.

12 kuyucuklu bir plaka kullanırken genellikle metal pens kullanırım. Plakalardaki parçaları birbirine geçirmek için taşıdığımda, genellikle önce daha büyük parçayı kuyucuğa yerleştiririm ve onu tamamen bir kenara doğru itirim. Ardından, tamamlayıcı onarım parçasını alıp kuyucuğun diğer tarafına yerleştiririm ve her bir deliğe birer pens sokarak onları birbirine doğru iterim.

Artık parçaları gerek boşluk konfigürasyonunda gerekse temas konfigürasyonunda birbirine kilitleyebilirim. Parçaları ayırmak istediğimde, önce parçaları boşluk konfigürasyonuna getirip ardından parçayı çıkarmak için dikey olarak yukarı çekmeyi tercih ediyorum. Cihazlar silikondan yapıldığı için uygun hücre yapışmasını sağlamak amacıyla kaplanmaları gerekir.

Cihazları muhtemelen polistiren ile kaplanmış ve plazma işlemi uygulanmış olarak alacaksınız, bu nedenle başlangıç noktamızın bu olduğunu varsayacağız. Öncelikle, hepatositlerin yapışacağı yüzeyi kaplamak için kollajen kullanacağız. Hepatosit taraklarını 50 µg/mL konsantrasyonunda kollajen çözeltisine yerleştirip 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edeceğiz.

Öte yandan, fibroblast taraklarını kaplamamıza gerek yoktur. İnkübasyon sonrası, kolajen solüsyonunu aspire ederiz ve suyla yıkarız. Şimdi, hücre ekimi için düz bir yüzey oluşturmak amacıyla ES'leri tamamlayıcı parçalarla temas edecek şekilde birbirine kilitleyeceğiz.

İlk olarak, bazı kuyucukları %70 etanol ile dolduracağız. Her kuyucuğa bir çift yerleştireceğim ve ardından bunları birbirine kilitleyeceğim. Kilitleme işleminden sonra, parçaların koplaner olduğundan emin olmak için onları mikroskop altında incelemek istiyoruz.

Parçalar ara sıra hizalanmamış şekilde birbirine kilitlenebilir. Bu durumda, mikroskop altında bunların iki farklı odak düzleminde olduğunu görürsünüz. Böyle bir durumda, parçaları basitçe ayırın ve tekrar birleştirin. Hizalamanın düzgün olduğunu kontrol ettikten sonra, sterilizasyon için parçaları bir süre etanolde bekletiyoruz.

Genellikle acelem olduğu için sadece 10 dakika boyunca bekletiyorum. Sterilizasyondan sonra durulama yapmamız gerekir. Etanolü tamamen aspire edin ve suyla yıkayın; ardından tekrar aspire edip suyla yıkayın ve son olarak suyu aspire edip kültür medyanızla değiştirin.

Şimdi hücreleri cihazlara ekelim. Tipik olarak, hücreleri mililitre başına 500.000 hücre konsantrasyonunda süspande ederiz ve 12 kuyucuklu bir plaka kullanarak her bir tarak çiftinin üzerine bir mililitre süspansiyon pipetleriz. Böylece, fibroblastları iki kuyucuğa mililitre başına 500.000 hücre olacak şekilde ekdik.

Benzer şekilde, kuyu başına 500.000 hepatosit içeren bir süspansiyon aldık ve bunları diğer iki kuyuya ekledik. Şimdi, inkübasyona geçmeden önce, hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için onları iyice çalkalayacağız. Ben hücreleri üç kez dikey, üç kez yatay yönde çalkalamayı ve ardından bu işlemi üç kez tekrarlamayı tercih ediyorum.

Çalkaladıktan sonra, örneği inkübatöre yerleştireceğiz ve hücrelerin 15 dakika boyunca bekletilmesini sağlayacağız; bu sürenin sonunda hücreleri tekrar çalkalayacağız. Bir saat boyunca her 15 dakikada bir çalkalama işlemi uyguladıktan sonra, hücre süspansiyonunu aspire edeceğiz ve yeni bir hücre süspansiyonu hazırlayacağız. Bu işlemi, konfluent bir hücre tabakası elde edene kadar tekrarlayacağız.

Genellikle fibroblastlar ile bir veya iki ekim gerçekleştirilir. Hepatositlerde ise bu sayı iki ile dört ekim arasında olabilir. Konfluent bir tek tabaka elde etmek için hücreler oldukça yüksek bir yoğunlukta ekilir; sallama işlemi, hücrelerin eşit şekilde dağılmasını sağlar.

İlk ekimden sonra, seyrek bir hücre tabakası oluşur. Hücrelerin sadece polistiren ve kolajen ile kaplanmış parmaklara tutunduğuna dikkat edin. Taze hücrelerin ekilmesinin ve her 15 dakikada bir çalkalama işlemiyle bir saat daha inkübe edilmesinin ardından, hücre tabakası daha yoğun hale gelir.

Üçüncü ekimden sonra yeterli hücre yoğunluğuna ulaştık ve hücreler taraklara ekildikten sonra işlemi durdurabiliriz. Hücreleri istenen deneysel konfigürasyona getirmek istiyoruz. Cihazlar şu an tamamlayıcı parçalarından ayrılmış durumdadır ve 24 saat boyunca inkübe edilirler.

24 saat sonra, hücreler tarakların yüzeyi boyunca yaygın bir konfluent monokatman oluşturmuş olacaktır. Şimdi bir ko-kültür oluşturmak istiyoruz. Hepatosit tarağı ve fibroblast tarağı şu an aynı kuyucuğa aktarılır ve istenen başlangıç konfigürasyonunda birbirlerine kilitlenirler.

İsteğe bağlı olarak, belirli bir süre sonra konfigürasyonu değiştirebilirsiniz. Örneğin, 18 saat sonra boşluk konfigürasyonuna geçebiliriz; parçalar aynı yere yerleştirilir, boşluk konfigürasyonuna ulaşana kadar iyice birbirine itilir ve ardından tekrar boşluk konfigürasyonuna gelecek şekilde temas ettirilir.

Şimdi bir tarağı çıkaracağız. Şimdi yapacağımız işlem; eski polistiren kaplamayı sökme, çipleri temizleme ve ardından yeni bir polistiren kaplama uygulayarak hücre kültürü için hazırlama sürecini gerçekleştirmek olacaktır. Eski polistiren kaplamayı söküp taze bir kaplama uygulayarak, önceki deneyden kalan hiçbir kalıntının yeni deneye müdahale etmemesini sağlarız.

Deneyinizi tamamladıktan sonra, ilk yapmanız gereken hücrelerinizi çamaşır suyuyla temizlemek, ardından taraklarınızı suyla durulamaktır. Çipleri tüpe yerleştirmeden önce, tamamen kuru olduklarından emin olmalısınız. Burada, bir süre havada kurumaya bıraktığım ve tamamen kuruyup kurumadığını kontrol ettiğim birkaç tarak bulunmaktadır.

Şimdi bir miktar tulueni alıp bu cam kaba koyacağız. Çözünmeyi önlemek için burada cam pipet kullanacağız. Tuluen plastiği çözdüğü için tipik bir polistiren pipet kullanamayız.

Tamam, bu kadar yeterli. Şimdi bu parçalardan birkaçını alıp toluenin içine yerleştireceğim ve çalkalamak için sarsıcının düğmesini açacağım; toluenin buharlaşmasını önlemek için üzerini alüminyum folyo ile kapatacağız. İki saat sonra, toluen tarakların üzerindeki polistirenin çoğunu çözmüş olmalı, böylece tarakları çıkarıp havada kurumaya bırakabiliriz.

Halloween durulamasından sonra, parçalar nispeten polistirenden arındırılmış ve oldukça temiz olmalıdır. Bununla birlikte, parçaların aşırı derecede temiz olması gerekir; aksi takdirde, yeni polistiren tabakası yeterli yapışmayı sağlayamayacaktır. Hücreler çekmeye başladığında, polistiren tabakası deneyin ortasında soyulma eğilimi gösterir.

Şimdi piranha asidi ile temizleme işlemi gerçekleştireceğiz. Parçaları cam bir behere yerleştirdim ve bunları ısıtacağız. Bu nedenle beheri bir ısıtıcı plaka üzerine koyacağız.

Burada sülfürik asit ve hidrojen peroksit bulunuyor. Önce sülfürik asidi dökeceğim ve burada, tüm çiplerin sıvının altında kaldığından emin olacağım. Bazen yüzme eğilimi gösterebilirler.

Ayrıca şu anda oldukça korozif kimyasallarla çalıştığımız için doğru koruyucu ekipmanları giydiğinizden emin olun. Burada nitril eldivenler giyiyorum. Şimdi hidrojen peroksiti asidin içine dökeceğiz; burada dikkatli olalım çünkü bu ekzotermik bir reaksiyondur.

Gördüğünüz üzere reaksiyon sırasında hafifçe duman çıkıyor, ancak sistemin reaktivitesini daha da artırmak için enerji eklemek istiyoruz. Bu nedenle şimdi sıcaklığı yaklaşık 120 °C'ye çıkarıyoruz; böylece hücre kültürünüzden kalan tüm kalıntıların çiplerden tamamen temizleneceğinden emin olabilirsiniz. Bu aşamada, tüm hidrojen peroksit tüketilene kadar reaksiyonun tamamen tamamlanmasını beklemeniz gerekir.

Bu noktada karışımda kabarcık oluşumu duracaktır. Dolayısıyla reaksiyonun tamamlanması yaklaşık yarım saat sürer. Kabarcıkların kesildiğini gördüğünüzde, ısıtıcıyı kapatıp karışımın soğumasını bekleyebilirsiniz.

Ve bunları kavisli bir BAK su kabına transfer edeceğiz. Burada metal değil, Teflon cımbız kullandığınızdan tekrar emin olun; örnekleri tutup aktarabilirsiniz. Şimdi, örnekleri sabit bir ddH₂O akışı altında durulayacağız. Ben genellikle bunu doğrudan ana hattan alırım ve burada en az 10 dakika boyunca akış halinde bırakırım.

Böylelikle, doğrama işleminden sonra 10 dakika boyunca akan su altında yıkayarak tüm asit kalıntılarını temizleyeceğiz. Asit çiplerden tamamen uzaklaştırılmış olmalı ve polistiren kaplama aşamasına hazır olana kadar onları su altında saklayacağız; Sigma'dan temin ettiğimiz 45,000 molekül ağırlığındaki polistireni kullanacağız. Şimdi buradan küçük bir miktar tartacağız.

Elimizde 400 miligram madde var ve bunu 100 miligram/mililitre konsantrasyonda toluen içerisinde çözeceğiz. Dolayısıyla toluen ile çeker ocak altında çalışılmalıdır. Diğer önemli nokta ise, polistireni çözmek için toluen kullanacağımızdan, polistirenden yapılmış herhangi bir laboratuvar malzemesi kullanmadığımızdan emin olmalıyız.

Burada polipropilen, konik tüp ve cam pipet kullanıyoruz. 400 mg polistiren olduğundan, içine 4 mL toluen ekleyeceğim. Polistiren çözünene kadar yarım saat boyunca vorteksleyeceğiz. Şimdi tüpü en düşük hızda yaklaşık 20 dakika ile yarım saat arası vorteksleyeceğiz.

Şimdi tüpü vortekse sabitleyeceğim. Tüm süre boyunca burada tutmama gerek yok. 20 ila 30 dakika sonra polistiren çözünmüş olmalı ve kaplama işlemine hazır hale gelmeliyiz.

Şimdi polistireni tesisimizdeki spin coater cihazı ile kaplayacağız. Spin coater cihazımız bir temiz oda tesisindedir. Bu nedenle burada bone, koruyucu gözlük, önlük, galoş ve eldiven giymemiz gerekiyor, ancak sizin tesisinizde bu durum farklı olabilir.

Bu mandreni kullanmadan önce, onu polistirenden korumak istiyorum. Bu nedenle üzerini alüminyum folyo ile kaplayacağız ve çipin yüzeye tam olarak oturması için folyoyu yüzeye mümkün olduğunca düz bir şekilde yayacağız. Çip üzerinde vakum tutmaya devam edebilmek için tam merkeze küçük bir delik açacağız.

Santrifüj ayarları 2.400 RPM ve 30 saniye olarak belirlenmiştir. Şimdi çiplerimizden birini, çipin merkezi deliği kapatacak şekilde yerleştirebiliriz; polistireni koyarken başlangıçta vakumu kapalı tutacağım, ardından vakumu açıp santrifüjü başlatacağım. Daha küçük parçalar için 10 damladan biraz daha az koyabiliriz.

Daha büyük parçalar için, 10 damladan biraz daha fazla polistiren kullanılır. Ve bunu 2.400 RPM'de 30 saniye boyunca döndüreceğiz. Şimdi polistiren kaplı çipleri alıp 120 °C'deki fırına koyacağız. Bu sıcaklık, polistirenin camsı geçiş sıcaklığının üzerindedir.

Böylece yüzey, biraz daha pürüzsüzleşmesi için yeniden eriyecek, ayrıca plastik yoğunlaşacak ve sertleşecektir. Bu nedenle, genellikle bir gece boyunca fırında bırakıyorum. İşlemin tamamlanması muhtemelen en az birkaç saat sürer.

Gece boyunca fırınlama işleminin ardından çipler plazma işlemine hazır hale gelir. Şimdi polistireni oksijen plazmasına maruz bırakacağız; bu işlem, proteinlerin ve hücrelerin yüzeye daha iyi tutunmasını sağlamak için yüzey enerjisini değiştirecektir. Çipleri plazma odasına yerleştirip vakumlama işlemini gerçekleştireceğiz.

Kullanılacak uygun ayarlar, oksijen gazı akışı altında bir dakika boyunca 200 mTorr vakum ve 200 watt güçtür. Sistem tahliye edildiğine göre, oksijeni sisteme vereceğiz. Tamam, şimdi RF gücünü açabiliriz ve plazmayı bir dakika boyunca ateşleyebiliriz.

Plazma çalıştığında aslında ışık yayar. Bu, floresan bir ampul gibidir. Bir dakikalık plazma maruziyetinden sonra, basıncı tekrar atmosferik seviyeye getireceğiz ve parçaları dışarı çıkarabileceğiz.

Şimdi parçalar protein kaplaması ve hücre besleme işlemleri için hazır. Bu cihazı tasarlarkenki amacımız, dokunun mikro mimarisini dinamik bir şekilde manipüle edebilmekti. Dolayısıyla vücuttaki dokunun mikro organizasyonu, özellikle hücrelerin birbirlerine göre konumlandırılması, laboratuvar kültüründeki her bir hücrenin işlevinin belirlenmesinde büyük önem taşımaktadır.

Kısa bir süre öncesine kadar bunu başarılı bir şekilde taklit edemiyorduk; ancak son beş veya on yıl içinde, araştırmacılar hücreleri bir doku kültürü substratı üzerine mikro desenlerle yerleştirmeye başladılar ve böylece hücreleri bir doku kültürü plağında tam olarak istediğimiz noktalara konumlandırabildiler. Bunu yaparak, hücre-hücre etkileşimlerinin mikro ölçekteki temel biyolojisine dair bazı önemli yönleri keşfetmeyi başardılar. Şu ana kadar yapamadığımız şey ise bunu dinamik bir şekilde gerçekleştirmekti.

Yani, deneyinizin ortasında bir hücre kültürünün organizasyonunu değiştirmekten bahsediyoruz. Bu önemlidir çünkü vücutta doku aslında statik bir ortam değildir. Özellikle yara iyileşmesi veya gelişim sürecinde, hareket eden ve yeniden organize olan hücrelerimiz vardır.

Ancak homeostaz durumundaki normal bir organda bile çok sayıda yapı hareket halindedir. Öğrenilmesi gereken teknik açıdan en zor kısım, parçaların fiziksel olarak nasıl manipüle edileceğidir. Sisteme çalışmaya ilk başladığınızda, parçaların ne kadar hassas olduğu veya yapmanız gereken hareketlerin ne kadar küçük olduğu karşısında çekinebilirsiniz.

Ancak, cihazla kısa bir süre pratik yaptıktan sonra çok fazla sorun yaşamayacağınızı düşünüyorum. Bu cihazın rol oynadığı bazı durumlar, örneğin embriyonik gelişimde, hücrelerin çeşitli embriyonik tabakalardan tomurcuklanırken bir dizi farklı hücre ortamıyla temas etmesidir. Bu tabakalarla sırayla temas ettiklerinde gerçekleşen etkileşimlerin, bizi belirli bir farklılaşma yolu boyunca daha ileriye taşıdığı bilinmektedir.

Bu nedenle, bu tür bir cihazın, laboratuvar ortamında bu tip bir olayı taklit etmek için uygun olabileceğini düşünüyoruz. Mikro organizasyonun özellikle incelemek istediğimiz yönlerinden biri, hücre zarlarının birbirine temas edebildiği temas etkileşimleri aracılığıyla iletişim kuran hücreler ile çevre ortama salgılanan ve biraz daha uzaktaki bir hücreye doğru difüze olan çözünür faktörler arasındaki farktı. Hücreler ko-kültürde olduğunda ve birbirleri üzerinde bir etkiye sahip olduklarında, çoğu zaman bu etkileşimlerde rol oynayanın temas etkileşimleri mi yoksa salgılanan faktörler mi olduğu netleşmemiştir.