Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Epitel dokuların korunması, bariyer fonksiyonunu bozmadan hasarlı ve ölen hücrelerin sürekli olarak uzaklaştırılmasını gerektirir. Bunu başarmak için epitel, ölen hücreyi dışarı atmak ve hücrenin çıkışından kaynaklanabilecek boşlukları kapatmak amacıyla, ölen hücreyi çevreleyen hücrede bir aktin ve miyozin halkası oluşturup daraltarak ölen hücrelerin ekstrüzyonunu gerçekleştirir. Bu video makalesinde, larva zebra balığı epidermisinden apoptotik hücre ekstrüzyonunu gerçek zamanlı olarak indüklemek ve görüntülemek için bir yöntem sunulmaktadır.

Gösterilen işlemde bu, epitel dokulardaki aktin filamentlerini görselleştirmek amacıyla, epidermislerinde yeşil floresan protein eksprese eden transgenik zebra balığı embriyolarının tek hücreli evresine, kırmızı floresan proteinle işaretlenmiş bir F aktin probunun enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Hem GFP hem de RFP eksprese eden dördüncü gün sonrası larvalar, epidermiste apoptozu indüklemek için G418 ile işleme tabi tutulur. Ekstrüzyon sırasında meydana gelen aktin dinamikleri ve epitel hücre şekli değişiklikleri, döner disk konfokal mikroskop üzerinde zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) ile görselleştirilir.

Bu tekniğin, immün kuvvet ve analizler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı bir epitelyal dokuda ekstrüzyon süreci sırasında meydana gelen hızlı değişimleri ve aktin dinamiklerini gözlemleyebilmemizdir. Bu videoda, gelişmekte olan zebra balığı epidermisinden apoptotik hücrelerin ekstrüzyonunun gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bariyer fonksiyonunu korurken apoptotik hücreleri uzaklaştırmak için hücrelerin aktin sitoiskeletlerini nasıl koordineli bir şekilde yeniden düzenlediklerini ve ekstrüzyon sürecindeki bozulmaların nasıl belirli hastalık durumlarına yol açabileceğini anlamak için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Gelişmekte olan zebra balığı epidermisindeki hücre ekstrüzyonu sırasında aktin dinamiklerini görselleştirmek için, önceden transkribe edilmiş RNA'yı buz üzerinde çözerek başlayın. Utrofinin calponin homoloji domenine ve aktin bağlayıcı proteine füzyonlanmış kırmızı floresan protein kodlayan Mr.mRNA'yı transkribe ediyoruz. Yaklaşık 30 ng/µL nihai RNA konsantrasyonu elde etmek için RNA'ya bir bire bir oranda fenol kırmızısı ekleyin ve çözeltiden 1 µL'yi geri doldurma yöntemiyle çekilmiş bir kapiler iğneye yükleyin.

E üç tamponunda yaklaşık 75 adet 1 hücreli evre C-K-G-F-P embriyosu toplayın. Toplanan embriyoları beş üç çeyrek pasta pipeti ile mikroenjeksiyon kalıbına aktarın ve embriyoları oluk içerisinde FST Dumont numara beş pensi ile nazikçe yönlendirin. Standart bir laboratuvar diseksiyon stereo mikroskobu altında, RNA'nın çoklu evrelerdeki embriyolara enjekte edilmesini önlemek için hızlı çalışın.

RNA'yı embriyoların sarısına fenol fosili olarak enjekte etmek için basınç kontrollü bir mikro enjektör kullanın. Enjeksiyondan sonra embriyoda kırmızı renk görülmelidir. Her deney için en az 50 embriyoya enjeksiyon yaptığınızdan emin olun.

Döllenmemiş veya hasarlı yumurtaları ayıklamak için embriyoları seçin ve geri kalan tüm embriyoları 28 °C'de inkübe edin. 24 saat sonra, epidermiste yüksek düzeyde GFP floresansı ve RFP işaretli aktin floresansı gösteren zebra balığı embriyolarını seçmek için floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. Seçilen embriyoları, aminoglikozid maruziyeti ile apoptozu indüklemek için ilaç uygulamasına geçilene kadar 28 °C'de inkübe edin.

Antibiyotik G 418 veya ilaç, gelişmekte olan zebra balığı larvalarının epidermisinden apoptotik hücrelerin ekstrüzyonuna neden olur. Önemli olan şudur ki, bu uygulama hücre ekstrüzyonunu indüklemek için yalnızca döllenmeden sonraki dördüncü gün ve daha büyük olan larvalarda etkilidir. Hem GFP hem de RFP eksprese eden, döllenmeden sonra 4 günlük 25 adete kadar zebra balığı larvasını, üç mililitre E3 ortamı içeren 35 x 10 milimetrelik bir kültür kabına toplayın.

Besiyerini, 1 mg/mL G four 18 içeren üç mililitre E three ile dikkatlice değiştirin ve larvaları ilaç içinde 28 °C'de, karanlıkta dört saat inkübe edin. Ardından besiyerini uzaklaştırıp yerine önceden ısıtılmış %0,02 trica içeren E three besiyeri ekleyin ve görüntüleme için larvaların montajına geçin. Üç adete kadar larvaları 1,5 mililitrelik bir fendor tüpüne aktarın ve E three besiyerinin çoğunu uzaklaştırın.

Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak tüpün içine 120 µL %1 düşük erime noktalı agar ekleyin ve karıştırın. Ardından, larvaları ve agar karışımını bir matech kültür kabının tabanındaki lamel üzerine nazikçe pipetleyin. Ek bir iğne veya tungsten iğne takılı bir FST pin tutucu kullanarak, larvaları hızla düzeltin ve lamele paralel ve düz olacak şekilde konumlandırın.

Dozun katılaşmasını bekleyin. Ardından kabı, %0,02 trica içeren E three besiyeri ile nazikçe doldurun. Gelişmekte olan zebra balığı larvalarının epidermisinden apoptotik hücrelerin ekstrüzyon sürecinin tamamının yaklaşık 20 dakika sürdüğünü tespit ettik.

Burada, zebra balığı epidermisinin tek bir katmanı boyunca bir dizi Z düzlemi toplamak için döner disk konfokal mikroskop ve and or IQ yazılımı kullanarak bir zaman atlamalı görüntüleme deneyinin nasıl kurulacağını gösteriyoruz. İlk olarak, and or IQ yazılımı üzerinden argon ve helyum neon lazerleri, mikroskop kamerasını ve epi floresan lambayı çalıştırın. Görüntülenecek dalga boylarını içeren bir zaman serisi protokolü oluşturun.

Görüntü yakalama aralıklarının sıklığı ve yakalamanın kaç kez tekrarlanması gerektiği belirlenir. Numuneyi içeren mattec kabını dikkatlice mikroskop tablasına yerleştirin ve ardından larvalara odaklanmak için transmisyon ışığı ile 20 kat objektif kullanın. 40 kat su daldırma objektifini doğru konuma getirin. Bu objektifi kullanarak, alan başına yaklaşık 20 ila 25 hücreyi görüntüleyebiliriz; bu da subcellular aktin dinamiklerini çözümlerken aynı zamanda ekstrüzyon sırasındaki hücresel davranışları takip etmemize olanak tanır.

40x objektifin üzerine dikkatlice bir damla su bırakın ve mattec kabını hızla üzerine yerleştirin. Aydınlık alan aydınlatması kullanarak örneği tanımlayın ve ardından özellikle GFP pozitif epidermise odaklanmak için 488 nanometre epi floresan aydınlatma kullanın. Konfokal tarama moduna geçin.

Her bir kanal için lazer yoğunluğunu ve pozlama süresini uygun şekilde ayarlayın. Sinyalinizin optimal tespiti için ve herhangi bir fototoksisiteyi önlemek adına lazer gücü ile pozlama süresini dengelemeye özen gösterin. Dışarı çıkan hücreleri belirlemek için, GFP ile işaretlenmiş epidermisi görselleştirmek amacıyla epi floresansı kullanın ve ortadaki küçük yuvarlak bir hücreyi çevreleyen bir hücre topluluğundan oluşan, klasik rozet paternindeki bir hücre grubunu tanımlayın.

Ek olarak, hücre ekstrüzyonunun karakteristik bir özelliği olarak, ortadaki küçük yuvarlak hücrenin etrafında bir halka şeklinde RFP ile işaretlenmiş aktin birikimi görülmelidir. Ekstrüzyona uğrayan bir hücre belirlendiğinde, Z Serisi için üst ve alt limitleri ve adım boyutunu hızlıca ayarlayın. Ardından, verileri incelemek, aktin halkasının büzülmesini ve ölen hücre çevresinde meydana gelen epitel davranışlarını görselleştirmek için dört D konfokal veri seti almaya başlayın.

Zaman içinde, Z serisinin 3B projeksiyonlarını oluşturun ve verileri bir film dosyası olarak kaydedin. Bu adım, çeşitli yazılım paketleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu şekil, döllenmeden dört gün sonraki bir CK GFP zebra balığı larvasının epidermisinde RFP UTR CH ekspresyonunu göstermektedir.

Burada, canlı etkileşim dinamiklerini takip eden bir zaman ayarlı videodan alınan durgun kare Z projeksiyonları yer almaktadır. Epitel hücre ekstrüzyon süreci sırasında, oklar komşu hücreler tarafından oluşturulan ve iki dakika boyunca kasılıp kapanan aktin halkasını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, ekstrüzyonun değiştirilmesinin belirli hastalık durumlarına nasıl yol açabileceğini daha iyi anlamak için, kimyasal inhibitörlerin veya genetik mutasyonların kullanımı gibi diğer yöntemleri bu teknikle kombinasyon halinde kullanabiliriz.

Apoptotik hücrelerin temizlenememesinden kaynaklanan bu süreçle ilgili olarak, gelişmekte olan zebra balığının epidermisinden gerçekleşen ekstrüzyon sürecini görselleştirmek için zaman ayarlı (time-lapse) bir görüntüleme deneyinin nasıl kurulacağını size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, fotobleşingi veya toksisiteyi önlemek için örneğin maruz kaldığı ışık miktarını sınırlamayı hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.