Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Bu prosedürün amacı, floresan probları TMRM ve H 2D CFD kullanarak primer kortikal nöronlarda sırasıyla mitokondriyal membran potansiyelini ve reaktif oksijen türleri seviyelerini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle TMRM ve H 2D CFDA'nın stok ve çalışma konsantrasyonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kortikal nöronların TMRM ve H 2D CFDA ile oda sıcaklığında, Thai roads tamponu içerisinde 45 dakika boyunca inkübe edilmesidir.

Üçüncü adım, canlı kortikal nöronlardaki TMRM ve DCF floresans yoğunluğunun sırasıyla 515/517 nanometre ve 488/515 nanometre eksitasyon emisyonu kullanılarak görüntülenmesidir. TMRM floresansındaki değişiklikler mitokondriyal üzerindenleştirici FCCP varlığında, DCF floresansındaki değişiklikler ise hidrojen peroksit varlığında izlenecektir. Bu prosedürün son adımı verilerin toplanması, normalizasyonu ve analizidir.

Nihayetinde, sırasıyla FCCP ve hidrojen peroksit uygulaması öncesi ve sonrası TMRM ve DCF floresans yoğunluğunun bağıl seviyelerini gösteren bir grafik çizilerek sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Joanna Koska. Loyola University Chicago'daki laboratuvarıma hoş geldiniz.

Bugün size sırtan kortikal nöronlarda mitokondriyal membran potansiyelinin ve reaktif oksijen türlerinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. İşlem, dhi tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Merhaba, ben Denise Jossi.

Bu prosedür kullanılarak, tekil mitokondriyal işaretlemede mitokondriyal membran potansiyeli ve tek hücreli işaretlemede reaktif oksijen türleri ölçülebilir. Öyleyse başlayalım. Beş miligram TMRM'yi bir mililitre susuz dimetil sülf oksitte çözerek 10 milimolar bir TMRM stok çözeltisi hazırlayın ve bir dakika boyunca vorteksleyin.

Ardından alikotlar hazırlayın ve alikotları -20 °C'de saklayın. Işıktan koruyun ve bir ay içinde kullanın. Sonra, 4,87 mg H 2D CFDA'yı 1 mL susuz dimetil sülf oksitte çözerek 10 mM'lık bir H 2D CFDA stok çözeltisi hazırlayın.

Benzer şekilde, bir dakika boyunca vorteksleyin, ardından alikotlar oluşturun ve -20 °C'de saklayın. Işıktan koruyun ve sıçan kortikal nöronlarını öncelikle TMRM ile yüklemek için bir hafta içinde kullanın. Kültürlenmiş nöronları tyro tamponu ile üç kez yıkayın.

Ardından, 10 millimolar TMRM stokunu tb içinde 1000 kat seyrelterek 20 nano molar TMRM hazırlayın. Daha sonra, her bir milliliter tb için iki microliter seyreltilmiş TMRM ekleyin. Nöronları TMRM ile oda sıcaklığında, karanlıkta 45 dakika boyunca inkübe edin.

45 dakika sonra, kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve rat kortikal nöronlarını H 2D CFDA ile yüklemek için görüntülemeye başlayın, kültürülen nöronları tb ile üç kez yıkayın. Ardından, 10 milimolar H 2D CFDA stokunu tb içerisinde 10 kat seyrelterek iki mikromolar H 2D CFDA hazırlayın. Daha sonra, her bir mililitre tb başına iki mikrolitre seyreltilmiş H 2D CFDA ekleyin.

Ardından, nöronları 45 dakika sonra oda sıcaklığında, karanlıkta 45 dakika boyunca H 2D CFDA ile inkübe edin. Fazla floresan indikatörü uzaklaştırmak için nöronları TB ile dört kez yıkayın; ardından, canlı zaman serisi programı uygulaması kullanılarak TMRM ile inkübe edilen nöronların canlı görüntülemesini gerçekleştirmek üzere konfokal lazer tarama mikroskopisi ile görüntüler elde edin. Görüntü elde etmek için gereken süreyi en aza indirmek ve fotobleşingi önlemek için düşük çözünürlük ve azaltılmış lazer gücü uygulayın.

Ardından, yansıtılmış ışık kullanarak TMRM ile yüklenmiş monte nöronların odağını ayarlayın. TMRM floresanını, 540 nanometre dalga boyunda aydınlatma ve 570 nanometrede dedeksiyon ile inceleyin. Çözünürlük, lazer gücü deteksiyonu, kamera kazancı ve görüntü elde etmek için kullanılan zaman ayarlı çekim aralığı dahil tüm parametreler ayarlandıktan sonra, kameranın deteksiyon kazancını doygunluk seviyesinin hemen altına getirin.

Deneyler arasında bu ayarları değiştirmeyin. Ardından, alanı değiştirin. Delta PSY M stimulusundaki değişiklikleri test etmek için görüntü toplamaya başlayın; örneğin, mitokondriyal membran potansiyelini sırasıyla önemli ölçüde depolarize veya hiperpolarize edecek olan 1 µM FCCP veya 2 µg/mL oligomycin uygulanabilir.

Bu değişiklikler, FCCP durumunda bazal floresans yoğunluğuna kıyasla TMRM floresans yoğunluğunda bir azalma veya TMRM floresans yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır. H 2D CFDA ile inkübe edilmiş nöronların canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için öncelikle kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve yansıyan ışığı kullanarak hücrelerin odağını ayarlayın. DCF floresansını 4 88 nanometre eksitasyon ve beş 15 nanometre emisyon ile inceleyin.

Ardından, lazer gücünü %5 ile 7 arasına ayarlayın, kazancı tespit edin ve çözünürlüğü 256 x 256 olarak belirleyin. Deneyler arasında bu ayarları değiştirmeyin. Son olarak, canlı görüntüler elde etmek için frekansı ayarlayın.

Zaman serisi programını kullanarak yeni bir alan seçin ve ROS seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için görüntüleme işlemine başlayın. Hücreleri 100 ila 200 micromolar hidrojen peroksit ilele işleme tabi tutun. Bu durum, bazal seviyeye kıyasla DCF floresans yoğunluğunda bir artışla kendini gösterecektir.

Alanları seçmek için LSM programındaki ilgi alanı (ROI) aracını kullanın. Ardından, sırasıyla TMRM veya ROS floresan yoğunluklarını ölçmek için görüntü hücrelerindeki mitokondriyal bölgelerden ROI'leri veya tüm hücre gövdesinden ROI'leri seçin.

Hücrelerin yanındaki bölgeleri seçin. Arkaplan floresan yoğunluğunu hesaplamak için birkaç ölçüm alın ve ortalama arkaplan yoğunluğunu hesaplamak için Microsoft Excel kullanarak her bir zaman noktası için her hücredeki ilgi bölgelerinin ortalama floresan yoğunluklarından ortalama arkaplan floresan yoğunluğunu çıkarın. Arkaplan yoğunluğunu çıkardıktan sonra, TMRM veya DCF floresan yoğunluğunu bazal floresan değerine göre normalize edin.

Bu formülü kullanarak, floresan yoğunluğundaki zamanla meydana gelen değişimleri gösteren grafiği oluşturmak için Sigma plot programını kullanın. Burada, TMRM ile inkübe edilmiş sıçan kortikal nöronlarının floresan görüntüsüne bir örnek verilmiştir. F-C-C-P-A mitokondriyal açıcının eklenmesi, mitokondriyal depolarizasyona ve TMRM floresan yoğunluğunun kaybına yol açar.

FCCP eklenmeden önce temel TMRM floresans seviyesi stabil kalır. TMRM floresans değişikliklerinin zaman içindeki kantitatif analizi, FCCP eklemesinden sonra TMRM floresansında anlamlı bir azalma olduğunu göstermektedir. Burada, DCF ile yüklenmiş sıçan kortikal nöronlarının bir floresans görüntüsü örneği yer almaktadır.

Hidrojen peroksit uygulanmadan önceki ilk 120 saniye boyunca bazal DCF floresans seviyesi değişmeden kalır. Hidrojen peroksit eklenmesi, hücre gövdelerinde DCF floresans yoğunluğunun artmasıyla sonuçlanır. DCF floresansının zaman serili ölçümleri, hidrojen peroksit uygulamalarından sonra artmış olan sabit seviyelerini göstermektedir.

Bu prosedürde, fotobeyazlama ve fototoksisiteden kaynaklanan artefaktları önlemek için düşük lazer gücü ve hızlı tarama hızı kullanmayı hatırlamak önemlidir. Deneyinizde başarılar dileriz.