Hücreler stellat Yedi Adımda

Bu prosedürün genel amacı, fare karaciğerinden hepatik stellat hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fare karaciğerlerinin sindirim enzimleri ile iki kez perfüzyonuna tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Perfüzyonun ardından, bir sonraki aşama olan in vitro sindirimin verimliliğini artırmak için karaciğerler küçük parçalara ayrılır.

Son adım olarak, hepatik yıldız hücreler yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile diğer karaciğer hücresi tiplerinden ayrılır. Nihayetinde hepatik yıldız hücreler elde edilir ve saflıkları ışık ve immünofloresan mikroskopisi ile değerlendirilebilir. Prosedürü bir laboratuvardan lisansüstü öğrencisi Patrick Meyer gerçekleştirecek. Fare karaciğerlerinin NC iki perfüzyonuna hazırlık olarak, önce SC bir tamponu ve enzim perfüzyon çözeltilerini 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.

Ardından, 6,5 mililitre/dakika hızında laminar akış elde etmek için peristaltik pompayı ayarlayın ve pompanın silikon tüpünü SC one solüsyonu ile dengeleyin. Şimdi, anestezi altındaki farenin derin sedasyonda olduğunu refleks kaybı ile doğrulayın. Ardından fareyi uygun bir taban üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.

Abdominal ciltte boylamsal bir insizyon yapmak ve peritonu açığa çıkarmak için makas ve pens kullanın. Portal veni açığa çıkarmak için peritonu dikkatlice açın ve bağırsakları abdominal boşluktan hayvanın sol tarafına doğru kaydırın. Bu prosedürün en zoryla kısmı, gösterilecek olan karaciğerlerin sindirim enzimleri ile zeto perfüzyonudur.

Ardından, kanül yerleştirilirken bir stereo mikroskop kullanmak ve perfüzyon sırasında karaciğer yapılarındaki değişimi yakından izlemek önemlidir. Stereo mikroskop altında çalışırken, infüzyon setinin kanülünü portal vena içerisine yerleştirin. Karaciğerin perfüzyonuna 30 mL SC one çözeltisi ile başlayın. Akışı başlattıktan hemen sonra Vena Cava inferior'u açın.

Karaciğerin başarılı bir şekilde yıkanması, karaciğer dokusundaki renk kaybı ile anlaşılır; ardından karaciğeri 30 mililitre Pronase E çözeltisi ile perfüze edin. Pronase E çözeltisi ile perfüzyondan sonra karaciğer lobları şişecek ve lobüller kapsül üzerinden belirgin görünecektir; ardından 30 mililitre kollagenase P çözeltisi ile perfüzyon yapın. Kollagenase P perfüzyonu tamamlandığında, karaciğeri diyaframdan ve çevre organlardan dikkatlice ayırarak fareden çıkarın ve buz üzerinde 70 mililitre SC iki çözeltisi içinde saklayın.

Bu aşamada karaciğer şeklini kaybetmiş, atonik ve amorf görünmektedir. Fare karaciğerlerinin sindirilme işlemi, steril koşullar altında, laminer akışlı bir kabinde gerçekleştirilmelidir.

Karaciğerleri keskin bir makas kullanarak yaklaşık iki çarpı iki çarpı iki kübik milimetrelik parçalara bölün. Ardından, 70 mililitre SC iki süspansiyonunu ve karaciğer parçalarını 50 mililitre proteaz E kolajenaz P çözeltisi ile birleştirin. Bir mililitre dna, bir çözeltisi ekleyin ve karaciğerleri karıştırarak 37 °C'de 20 dakika boyunca sindirin.

Karaciğer dokusunun enzimatik sindiriminden sonra, yıldız hücreler yoğunluk gradyanı santrifügasyonu ile diğer hepatik hücre tiplerinden ayrılır. Bu prosedüre başlamak için, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik hücre süzgeçlerinden geçirerek altı adet 50 mililitrelik falcon tüpüne filtreleyin ve hücreleri E iki tamponu ile yıkayıp 600 Gs ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifügasyon sonrası, her tüpteki süpernatantın 40 mililitresini dikkatlice aspire edin.

Ardından, her tüpe 150 µL DNA's, one çözeltisi ekleyin ve hücreleri yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonlarını dört adet 50 mL'lik Falcon tüpünde birleştirin ve 4 °C'de 600 ×g'de 10 dakika boyunca G-B-S-S-P santrifüjü ile yıkayın. Pelete zarar vermeden süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice aspire edin ve her tüpe 150 µL DNAs one çözeltisi ekleyin.

Hücre peletlerini tüp başına 10 mililitre G-B-S-S-B içinde süspanse ediyoruz. Hücreleri iki adet 50 mililitrelik falcon tüpünde topluyoruz ve tüp başına toplam hacim 36 mililitre olacak şekilde G-B-S-S-B ekliyoruz. Her bir tüpe 14 mililitre den solüsyonu ekleyip iyice karıştırıyoruz.

Ardından, hücre süspansiyonundan 10 mililitreyi bir adet 12 mililitrelik gradyan santrifüg tüpüne aktararak toplamda 10 tüp elde edin. Hücre süspansiyonunun üzerine, tüp başına 1,5 mililitre G-B-S-S-B'yi nazikçe ekleyin. Gradyanları ara vermeden 1500 Gs'de ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hepatositler tüpün dibinde çökelirken, yıldız hücreler ara yüzeyde beyaz bir halka şeklinde bulunur. Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, yıldız hücreleri içeren ara yüzeyi dikkatlice toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri G-B-S-S-B ekleyip 600 Gs'de ve dört °C'de 10 dakika santrifüj ederek yıkayın.

Süpernatantı aspire edin ve hücreleri takviyeli 20 mililitre DMEM içinde tekrar süspanse edin. Hücreleri saydıktan sonra, santimetrekare başına 2 × 10⁴ hücre konsantrasyonunda doku kültürü flasklarına aktarın ve hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Hazırlanmalarından yaklaşık iki saat sonra hepatik stellat hücreler adherent hale gelmelidir; ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için medyayı değiştirin.

Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin; bu protokol kullanılarak fare karaciğerlerinden hepatik yıldız hücrelerinin hazırlanmasına dair temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. İn vitro kültürün birinci ve üçüncü günündeki hücreler, hepatik yıldız hücrelerinin karakteristik morfolojisini sergilemektedir. Hücreler astroglial şekillidir ve lipid vezikül depolama özelliği göstermektedir.

Çekirdek bölgelerinde, izole edilen hepatik stellat hücrelerin saflığı, glial fibriler asit proteininin veya GFAP'nin ekspresyonu ile de doğrulanabilir. Bu görüntüler, hücre izolasyonunu takip eden üç günlük kültürleme sonrası hepatik stellat hücrelerde kırmızı renkte gösterilen temsili bir GFAP immünofloresan boyamasını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, saf stellat hücrelerden yeterli verim elde etmek için nöron karaciğerinden hepatik stellat hücrelerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

Karaciğer perfüzyonu sonrası etkili sindirimin sağlandığından emin olmak önemlidir. Son olarak, hepatik dal hücrelerinin morfoloji ve fenotipini değerlendirerek izole edilen hücrelerin uygun kimliğinin belirlenmesi hayati önem taşır.