3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Bu deneyin amacı, 3D doku benzeri steroidler üretmektir. Bu işlem, öncelikle kültüre edilmiş hücrelerin hasat edilmesi ve ardından tek hücre süspansiyonu oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Sonrasında, hücre süspansiyonundan damlalar, bir doku kültürü kabının ters çevrilmiş kapağının alt kısmına yerleştirilir.

Ardından kapak, nemlendirme haznesinin üzerine ters çevrilerek kapatılır. Son adım, agregatların oluşmasına izin vermek için asılı damlaların 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilmesidir. Bunlar daha sonra çalkalayıcı bir su banyosuna aktarılabilir ve beş güne kadar inkübe edilebilir.

Nihayetinde, sıkıştırma deneyleri, doku yüzeyi 10 simetrisi veya epifloresan mikroskopi aracılığıyla agregat kohezyonu veya hücre ayrışmasındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, örneğin geleneksel 2D doku kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 3D ortamda büyütülen hücrelerin, bir doku ortamındaki hücrelerin deneyimlediği hücresel etkileşimleri daha yakından taklit etmesidir. Bu yöntemin, bir PI'nin bile yapabileceği kadar basit olduğunu göstermek için uygulamalı olarak anlatacağım.

Bu deneye başlamak için, %90 konfluens düzeyindeki adherent hücreleri hasat edin. Öncelikle, kültür ortamını aspire edin ve hücre tabakasını iki kez PBS ile durulayın. Ardından PBS'yi aspire edin ve monokatman üzerine iki mililitre %0.05'lik tripsin EDTA çözeltisi pipetleyin.

Plakayı 37 °C'lik doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreler ayrılana kadar inkübe edin. Ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve işlemi durdurun. İki mililitre tam besiyeri ekleyin.

Hücreler tamamen süspansiyona girene kadar karışımı titre etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun içine 10 miligram/mililitre konsantrasyonda 40 mikrolitre DNA çözeltisi pipetleyin ve inkübasyon sonrası oda sıcaklığında beş dakika bekletin.

Hücre süspansiyonunu kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından 200 ×g'de beş dakika santrifüj edin. Santrifüjleme işlemi tamamlandığında, S süpernatantını aspire ederek atın, ardından yıkama yapmak için peleti bir mililitre kompleten ortamda yeniden süspanse edin. Santrifüjleme işlemini tekrarlayın ve peleti bir mililitre kompleten ortamda yeniden süspanse edin.

Ardından, otomatik bir hücre sayıcı veya hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın. Hücre süspansiyonunu, besiyeri ile 2.5 × 10⁶ hücre/mL nihai konsantrasyona ayarlayın. Daha sonra asılı damla oluşumuna geçin.

60 milimetrelik bir doku kültürü tabağının kapağını çıkarıp tabağın tabanına beş mililitre PBS pipetleyerek bir nemlendirme odası hazırlayın. Plağın kapağını ters çevirin ve kapağın alt kısmına 2010 mikrolitre hücre süspansiyonu damlaları damlatın. Damlaların birbirine değmeyecek kadar yeterli mesafede yerleştirildiğinden emin olun.

Damla kültürlerini içeren kapağı, PBS içeren kabın altına nazikçe geri yerleştirin. Kültür plağını bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. 37 °C, %5 karbon dioksit ve %95 nem değerlerine ayarlayıp gece boyunca inkübe edin.

Damlaları günlük olarak takip edin ve hücre tabakaları veya agregatlar oluşana kadar inkübasyona devam edin. Hücre tabakaları veya agregatlar oluştuktan sonra, bunları üç mililitre tam besiyeri içeren yuvarlak tabanlı cam çalkalama balonlarına aktarın. Hücre tabakaları veya agregatlar içeren balonları sallamalı bir su banyosunda inkübe edin.

Steroid oluşumu bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenene kadar yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında tutulur. Steroidler oluştuktan sonra, deneysel manipülasyonların steroid oluşumu üzerindeki etkisi, yazılı protokolde belirtilen prosedüre göre nicelendirilebilir. Ayrıca, daha önce eklenmiş olan herhangi bir floresan boyanın membran interkalasyonu, floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir.

Bu parlak alan mikroskop görüntüsü, asılı damla yöntemi kullanılarak 18 saatlik inkübasyon sonrası sıçan prostat kanseri MLL hücrelerinin agregasyonunu göstermektedir. Bu görüntü, asılı damla yöntemi kullanılarak yapılan 18 saatlik kültür sonrası oluşan ikinci bir MLL hücresi agregatını göstermektedir. Bu hücreler, 25 micromolar MEK inhibitörü PD 9 8 0 5 9 varlığında kültüre edilmiş olup, sonuçta önemli ölçüde daha kompakt bir hücre agregatı oluşmuştur.

Burada, MEK inhibitörü ile işlem görmüş MLL asılı damla kültürü agregat boyutu ile işlem görmemiş kontrol agregat boyutu arasındaki fark gösterilmektedir. Yıldız işareti, P değerinin 0,0001'den küçük olduğu istatistiksel olarak anlamlı bir farkı temsil etmektedir. İşlem görmemiş ve MEK inhibitörü ile işlem görmüş agregatlar arasında yapılan öğrenci t-testi (Student's t-test) ile belirlenen bu durum, MEK inhibitörü uygulamasının anlamlı derecede daha küçük ve daha kompakt agregatlar oluşmasıyla sonuçlandığını göstermektedir.

Bu görüntü bir Nikon Smz 800 stereo mikroskop kullanılarak yakalanmıştır ve civciv embriyonik karaciğer hücrelerinin 18 saat boyunca asılı damla kültüründe, ardından 48 saat boyunca 37 °C'lik çalkalamalı su banyosunda inkübe edilmesiyle oluşan bir steroid yapısını göstermektedir. Bu konfokal mikroskop görüntüsü, belirli hücre popülasyonları asılı damla yöntemiyle birlikte kültüre edildiğinde meydana gelen ayrışma davranışını ortaya koymaktadır; asılı damla kültürüne geçilmeden önce civciv embriyonik karaciğer hücreleri PKH2 membran inter kaplama boyası ve civciv embriyonik hücreleri ile boyanmıştır.

Kalp hücreleri PKH 26 ile boyandı. Hücre süspansiyonları daha sonra karıştırıldı ve asılı damla yöntemi uygulandı. Kültür işlemi 18 saat boyunca gerçekleştirildi ve ardından 37 °C'deki çalkalayıcı su banyosunda 48 saatlik inkübasyon yapıldı.

Optik kesitten, sarı renge boyanmış kalp hücrelerinin karaciğer hücreleri tarafından çevrelendiği görülmektedir. Burada maviye yalancı renklendirilmiş olanlar, yüzeylerinde NCA eksprese eden iki nardi ve transfekte L hücre klonlarıdır. Bunlar, 2,4'e bir oranında, eşit oranlarda karıştırılmış floresan membran içine yerleşen boyalar PKH 2 ve PKH 26 ile boyanmış ve daha önce olduğu gibi asılı damlacıklar şeklinde kültüre edilmiştir.

Bu örnekte, yeşil yalancı renge boyanmış yüksek düzeyde cadian eksprese eden hücreler, kırmızı yalancı renge boyanmış daha düşük düzeylerde en cadian eksprese eden hücreler tarafından çevrelenmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem 30 dakika veya daha kısa sürede tamamlanabilir.