Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, karmaşık ekipman veya becerilere ihtiyaç duymadan, sırtan karaciğer hücrelerinin karma primer kültürlerinden birden fazla makrofaj kültürü elde etmektir. Bu işlem öncelikle, kollajenaz perfüzyonu ile erişkin sıçan karaciğer hücrelerinin disosiyasyonu ve ardından parankimal hepatosit hücre fraksiyonunun izolasyonu ile gerçekleştirilir. Daha sonra hücreler, karaciğer hücrelerinin karma primer kültürlerini oluşturmak için büyüme ortamı içeren T 75 doku kültürü flasklarında inkübe edilir.

Ardından 10 ila 12 günlük kültürden sonra, makrofajların plastik kaplara aktarılmasını kolaylaştırmak için kültür flaskları çalkalanır ve hücreler, kısa bir inkübasyon süresinin ardından seçici adezyon yoluyla toplanır. Son olarak, aynı T 75 doku kültürü flasklarından iki ila üç günlük aralıklarla iki haftadan fazla bir süre boyunca altı hücrenin 10 katından fazlası tekrar tekrar toplanabilir. Karaciğer makrofajları için izolasyon yöntemleri ayrıntılı olarak tanımlanmıştır.

Bununla birlikte, önceki yöntemlerin çoğu santrifüj illüstratörü gibi gelişmiş ekipmanlar ve ileri düzey teknik beceriler gerektirmektedir. Burada, özel bir ekipman veya ileri laboratuvar becerileri gerektirmeyen, yetişkin sarmal karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden yeterli sayıda ve saflıkta karaciğer makrofajları elde etmek için basit ve özgün bir yöntem sunuyoruz. Hayvan diseksiyonu, karaciğer perfüzyonu ve sit hazırlığı; Ulusal Hayvan Sağlığı Enstitüsü'nde Doktor Norco, Yamanaka ve Miko Yoshioka tarafından gösterilecektir.

Ardından, Ulusal Tarımsal Biyolojik Bilimler Enstitüsü'nden Dr. Taketo Takeno tarafından kültür ortamındaki karaciğer makrofajlarının izolasyonu ve saflaştırılması gösterilecektir. Öyleyse başlayalım. Sıçan karaciğerinin perfüzyonuna hazırlanmak için, bir şişe yıkama solüsyonunu ve bir şişe kollagenaz solüsyonunu önceden ısıtarak başlayın.

Ardından, deri sıkıştırma testi ile sedasyon onaylandıktan sonra, anestezi uygulanmış yetişkin bir erkek sıçanı paslanmaz çelik bir tepsiye yerleştirin ve karın ile göğüs bölgesine %70 ethanol püskürtün. Sonra, diseksiyon makasıyla karnın ortasında küçük bir kesi yapın ve deriyi geriye doğru soyun. Daha sonra makasla karnı açın ve portal venin konumunu doğrulayın.

Ardından, cerrahi ipliği portal venin altından geçirin ve ipliği gevşekçe sıkın. Daha sonra, kanın karaciğere geri kaçmasını önlemek için vena cava inferiorun distal kısmını ve mezenterik veni bir mosquito klemple kapatın. Diyaframı makasla keserek göğüs boşluğunu açın ve kalbi ortaya çıkarın; portal vende oftalmik makasla küçük bir insizyon yaptıktan sonra venin içine iki milimetrelik plastik bir kateter yerleştirin ve ipliği kateterin etrafında sıkıca bağlayın.

Perfüzyon sistemini önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi ile doldurun ve ardından katetere bağlayın. C iki'de dakikada 10 mililitre hızında perfüzyona başlayın. Aynı anda, disseksiyon makası ile sağ atrium duvarında bir kesi yapın.

Perfüzyona 10 dakika boyunca devam edin, ardından perfüzyon solüsyonunu kollagenaz solüsyonu ile değiştirin ve 10 ila 20 dakika boyunca perfüze edin. Dakikada 10 mililitre hızla, steril bir beheri 25 mililitre kollagenaz solüsyonu ile doldurun. Ardından perfüze edilen karaciğeri çıkarın ve dikkatlice beherin içine yerleştirin.

Karaciğeri makasla küçük parçalar halinde doğrayın. Oluşan hücre süspansiyonuna 75 milliliters soğuk MEM ekleyin. Nazikçe pipetledikten sonra, süspansiyonu 100 micrometer hücre süzgecinden geçirin.

Sindirilmemiş doku fragmanlarındaki bağ dokusunu uzaklaştırmak için filtratı 50 mililitrelik konik tüplere toplayın. Filtratı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri önce 4 °C'de bir dakika boyunca 50 G'de santrifüjleyerek dört kez yıkayın. Frenleme sonrası süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve ardından peleti soğuk MEM içerisinde yeniden süspanse edin; son yıkamadan sonra hücreleri tekrar santrifüjleyerek çöktürün.

Karaciğer hücrelerini büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri, santimetrekare başına 6,7 × 10⁴ hücre yoğunluğunda, beş ila 10 adet T 75 doku kültürü flaskına ekimleyin. Kültür flasklarını bir inkübatöre yerleştirin ve büyüme ortamını her iki ila üç günde bir yenileyin.

Bir günlük kültürden sonra, parenkimatöz hepatositler balon yüzeyine yayılır ve bir veya iki yuvarlak çekirdeğe sahip, tipik poligonal kopal taşı benzeri morfoloji gösterirler. Birkaç günlük kültür süreci içinde, parenkimatöz hepatositler epitelyal hücre morfolojilerini kaybeder ve daha yassı fibroblastik hücrelere dönüşürler. Altıncı gün civarında, faz kontrastında parlak yuvarlak makrofaj benzeri hücreler, fibroblastik hücre tabakası üzerinde çoğalmaya başlar. Makrofaj benzeri hücrelerin büyümesi 12. gün civarında maksimum seviyelere ulaşır.

Fibroblastik hücre tabakası dejenerasyona başladığında, yaklaşık 19. günde makrofaj benzeri hücrelerin sayısı azalır. Bu nedenle, yaklaşık yedi ila 10 günlük kültürden sonra, hücre tabakası üzerinde çoğalmış olan makrofajları, kültür balonlarının 30 dakika boyunca karşılıklı sallanmasıyla kültür ortamına süspanse ederiz. Her bir 100 milimetrelik doku kültürü sınıfı olmayan plastik tabağı, iki adet T 75 balonundan elde edilen ortamla doldurun.

Kültür flasklarını büyüme medyumu ile doldurun ve inkübatöre geri yerleştirin. İnkübasyon süresinin ardından plastik kapları 30 dakika boyunca inkübe edin; hücre ekiminden yaklaşık 10 dakika sonra, burada görüldüğü gibi, medyumu aspire ederek ve plastik kabı PBS ile nazikçe durulayarak kapları üç kez yıkayın; böylece makrofaj benzeri hücreler kap yüzeyine tutunmuşken, diğer kontamine fibroblastik hücreler süspansiyon halinde kalır. PBS durulamasının ardından, yüksek derecede saflaştırılmış bir makrofaj popülasyonu elde edilir.

Bu şekilde görüldüğü üzere, hücreler 40 dakikalık kültürden sonra tipik makrofaj morfolojisi kazanır ve oklarla belirtildiği gibi mitotik hücreler sıklıkla gözlemlenir. Bu yeni ve yüksek derecede saflaştırılmış makrofaj popülasyonunu toplamak için, yıkanmış hücrelere bir mililitre trip LE Express çözeltisi ekleyin ve kapları tekrar inkübatöre yerleştirip 10 dakika daha bekletin. Bu inkübasyon süresinin ardından, dokuz mililitre büyüme besiyeri ekleyin ve ardından yapışmış makrofajları hücre kazıyıcı ile nazikçe kazıyarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, santrifüj edin ve süpernatanı atın.

Bir mililitre büyüme besiyeri ekleyin, yeniden süspande edilen hücre kümelerini kuvvetli pipetleme yoluyla tekil hücrelere ayırın ve hücre sayısını bu grafikte gösterildiği gibi hemositometre ile belirleyin; altı hücrenin 10'dan fazlası, bir T 75 kültür flaskından iki ila üç günlük aralıklarla iki haftadan fazla süre boyunca tekrar tekrar hasat edilebilir ve bu durum T 75 kültür flaskı başına toplam 10⁷ hücre verimi sağlar. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, izole edilen hücreler CD 68 veya ED 1 ve CD 1 72 A veya OX 41 gibi sıçan makrofaj antijenlerine karşı monoklonal antikorlar ile immün boyanmıştır. Bu hücreler, FITC işaretli mikroboncukların aktif fagositozu gibi makrofajların fonksiyonel özelliklerine sahipti.

Bu videoda, yetişkin kırmızı karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden makrofaj elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sunduk. Prosedürümüz karmaşık ekipmanlar veya beceriler gerektirmez, ancak aynı fırça kültüründen tekrar tekrar toplanabilen yeterli sayıda saf makrofaj sağlar. Bu yöntem diğer memeli türlerine de uygulanabilir.

Videoyu izlediğiniz için teşekkür eder, gelecek deneylerinizde başarılar dileriz. Saygılarımızla.