Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, SI RNA Transfeksiyonu yoluyla DCS'deki hedef gen ifadesini baskılamaktır. Bu işlem, öncelikle AM Maxin Nucleo efektörünün programlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, DCS ve siRNA'yı birbirleriyle karıştırmak ve elde edilen hücre solüsyonunu Nucleo QVE modüllerine pipetlemektir.

Prosedürün üçüncü adımı, transfeksiyon işlemini başlatmak için plağı amaxa mekik tepsisine yerleştirmektir. Prosedürün son adımı ise interferon yanıtını aktive etmek için hücreleri virüsle enfekte etmektir. Nihayetinde, kantitatif R-T-P-C-R ve Western blotting yoluyla gen susturulmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu teknik, dendritik hücrelerdeki sinyal yolaklarının karakterize edilmesi için değerlidir ve dendritik hücre tabanlı immün tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. DC transfeksiyoni için Maxon 96 kuyucuklu shuttle nükleofaktörü programlamak için yeni bir parametre dosyası açın. İmleci 96 kuyucuklu plak şeması üzerinde sürükleyerek standart transfeksiyon için kullanacağınız kuyucuk sayısını seçin.

Her deneysel örnek için havuzlama yapmak amacıyla en az üç kuyucuk kullanın. Şimdi birinci bölümdeki program kodunu girin ve F'yi seçin, ardından ikinci bölümde açılır menülerden 1 68'i seçin. Daha sonra solüsyon kutusundan monocyte human seçeneğini, kontrol seçeneğinin altından ise standard seçeneğini seçin ve ardından apply butonuna tıklayın.

Transfeksiyon yapılmayan bir kontrol grubu eklemek için, diyagramdan ek kuyucukların seçilmesi gerekir. Ardından kontrol seçeneğinden "program kontrolü yok"u seçin ve tekrar uygula düğmesine tıklayın. Nukleofeksiyon solüsyonunu karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.

Gerekli sayıda nucleo vete modülünü, ilkini birinci ve ikinci sıralara yerleştirip ardından sonraki tüm tüpler için aynı işlemi tekrarlayarak, burada gösterildiği gibi doğru yönlendirmeyle nucleo VETE plakasına yerleştirin. Transfeksiyon için kuyuk başına 500.000 hücre düşecek şekilde, bir hücre kültürü flaskından yeterli miktarda DCS'yi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın; hücreleri 4°C'de 400 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Sonra, tüpe nuclear affection solüsyonu ekleyin ve ardından DCS'yi birkaç kez nazikçe pipetleyerek yeniden süspande edin.

Şimdi DPH tüplerini gerçekleştirilecek spesifik işleme göre etiketleyin ve ardından resüspande edilen hücreleri etiketli tüplere paylaştırın. Uygun epi endorf tüplerine, 500,000 hücre başına 0.25 micrograms final konsantrasyonunda SI RNA ekleyin ve ardından hücre süspansiyonlarını pipetleme yoluyla karıştırın. Transfeksiyon yapılmayan kontrol örneği için hedef dışı SI RNA kullanın.

Ardından, önceden programlanmış deneysel düzene göre 20 µL SI RA DC hücre süspansiyonunu nucleo vete modüllerine pipetleyin; sıvının kuyucuğun tabanına ulaştığından emin olun, nucleo vete plakasını bir kapakla kapatın ve DC'leri transfekte etmek için hava kabarcıklarının uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak amacıyla plakayı sert bir yüzeye birkaç kez hafifçe vurun. Hazırlanan nucleo Yvette plakasını nucleo effector 96 kuyucuklu taşıyıcı tepsiye yerleştirin. Daha sonra yükle (upload) ve başlat (start) düğmesine tıklayın.

Transfeksiyon sürecinin ilerlemesini ekrandan takip edin. Yeşil arka plan üzerindeki siyah bir artı işareti, o kuyucukta transfeksiyonun başarılı olduğunu; kırmızı arka plan üzerindeki siyah bir çubuk ise hücreler transfekte edilirken işlemin başarısız olduğunu belirtir. Transfeksiyon işlemi tamamlandığında önceden ısıtılmış DC büyüme ortamını hazırlayın, plakayı çıkarın ve her bir kuyucuğa 80 µL önceden ısıtılmış DC büyüme ortamı ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak plakayı 37 °C ve %5 CO2'de 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi boyunca, önceden ısıtılmış DC büyüme besiyerinden 100 µL'yi, nucleo küvet plakası kurulumuyla aynı yönde olacak şekilde matriks tüplerine ekleyin. İnkübasyon süresi sonunda, nucleo CVE'lerdeki hücre süspansiyonlarının tamamını (100 µL) önceden hazırlanmış matriks tüplerine aktarın.

Ardından, transfeksiyonun gerçekleşmediği tüpleri çıkarıp atın. Son olarak, matris tüplerini 24 saat veya istenen diğer zaman aralığı boyunca inkübe edin. İnkübe edilen her bir matris tüpü için einor tüplerini etiketleyin.

Ardından matris tüplerini inkübatörden hücre kültürü davlumbazına aktarın ve her bir deneysel örnek için matris tüplerini önceden etiketlenmiş eend dfs'lere birleştirin. Daha sonra, eend DPH tüplerini bir masaüstü santrifüjde 10 dakika boyunca 400 G'de döndürerek hücreleri nazikçe çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, 1 MOI oranında Newcastle hastalığı virüsü veya NDV içeren serumsuz büyüme ortamında gevşek bir şekilde yeniden süspande edin.

Epi endorfinleri steril bir şekilde kapatın ve ardından tüpleri 45 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresinin ardından, 900 µL DC büyüme ortamı ekleyin ve tüpleri sekiz ila 10 saat daha yeniden inkübe edin. Transfekte edilmiş ve enfekte edilmiş DC'leri toplamak için.

Einor tüplerini daha önce olduğu gibi masaüstü santrifüjde döndürerek hücreleri peletleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Monosit türevli DC'ler, RIG-I'yi hedefleyen siRNA veya spesifik olmayan glow siRNA ile transfekte edilmiş ve artı işaretiyle belirtildiği üzere NDV ile enfekte edilmiş veya eksi işaretiyle belirtildiği üzere enfekte edilmemiştir; bu durum kantitatif RT-PCR ile tespit edilmiştir. Transkripsiyon düzeyinde RIG-I'nin %75 oranında knockdown yapıldığı gözlemlenmiştir. İnterferon beta ekspresyonunda benzer bir azalma gözlemlenmiştir. İnterferon sinyal kaskadında RIG-I'nin bir downstream efektöründe de azalma gözlemlenmiştir. Ayrıca, enfekte edilmemiş kontrol transfekte hücrelerde interferon beta ekspresyonu tespit edilememiştir.

MXA ve interferon beta downstream yanıt geninkiyse minimal düzeydeydi. Burada, önceki şekilde yapıldığı gibi rigi hedefleyen irna ile DCS'nin ikinci bir transfeksiyondan elde edilen verileri gösterilmektedir. Ancak, hücrelerin tamamı NDV ile enfekte edilmiştir ve rezeke edilmemiş Monosit DCS kullanılarak ek bir kontrol dahil edilmiştir.

Gen susturma sonuçları, önceki şekilde gözlemlenenlerle benzerdi. RGA için yapılan western blot analizi, bu genin protein ekspresyonunun tamamen engellendiğini ortaya koydu. Birinci ve ikinci şeritler, rezeke edilmemiş hücre lizatlarına ait verileri göstermektedir.

Üç ve dört numaralı şeritler glow irna transfekte edilmiş hücrelerin lizatlarını, beş ve altı numaralı şeritler ise RIG I hedefli S Irna transfekte edilmiş hücrelerin lizatlarını göstermektedir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, birçok genin aynı anda susturulması dahil olmak üzere bir saat içinde tamamlanabilir.