Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Sınırlayıcı dilüsyon hücre transplantasyon deneyi, deneysel hayvan modellerinde kendi kendini yenileme potansiyelini değerlendirmek için altın standarttır. Bu gösterimde, floresan işaretli T-hücreli akut lenfoblastik lösemi geliştirecek transgenik zebra balıkları oluşturmak için tek hücre evresindeki sinjenik zebra balığı embriyolarına rag two MIC ve RAG two GFP enjekte edilir. Yaşamın 60. gününe gelindiğinde, birincil lösemi hücreleri zebra balıklarından izole edilir ve ardından floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemi kullanılarak saflaştırılır.

Ardından, hücreler sınırlayıcı dilüsyon ile yetişkin zebra balıklarının peritonal boşluğuna nakledilir ve balıklar 90 güne kadar tümör büyümesi açısından izlenir. Son olarak, orijinal tümör içindeki lösemi yayan hücrelerin frekansını belirlemek için ekstrem sınırlayıcı dilüsyon analizi istatistik yazılım programı kullanılır. Sınırlayıcı dilüsyon hücre nakli analizi, araştırmacıların tümör kitlesinin bütününde bulunan kendini yenileyen hücre sayısını doğru bir şekilde değerlendirmesine olanak tanır.

Kanser oluşumunu tetikleyen ve nihayetinde nükslerden sorumlu olanlar bu kendini yenileyen hücrelerdir. Zebra balığı modelinde sınırlayıcı dilüsyon transplantasyon analizleri yapmanın temel avantajı, her deney için birçok balığa transplantasyon yapılabilmesidir; bu da kendini yenileyen tümör yayan hücrelerin frekansını belirlerken daha yüksek bir kesinlik sağlar. Bu yöntem, T-hücreli akut lenfoblastik lösemideki tümör yayan hücrelere dair bilgi sunar.

Bu yöntem, diğer zebra balığı kanser modellerini anlamak için de uygulanabilir. Laboratuvar araştırmacısı Jessica Blackburn ve yetenekli teknisyen Sally Liu, bugün prosedürü size uygulamalı olarak gösterecekler. Rag2 CM ve RAG2-GFP DNA konstrüktlarını lineerize etmek için, her bir plazmidin 10 µg'ını NotI restriksiyon enzimi ile 37 °C'de gece boyunca sindirin. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesinin ardından, her bir plazmidi 20 µL su içerisinde süspande edin.

Sindirilmiş her bir plazmidin bire bir, bire beş ve bire 10 seyreltmelerini, 20 microliters, 10 microliters ve beş microliters yüksek aralıklı DNA merdiveni ile birlikte %1'lik agaroz jelde çalıştırarak DNA konsantrasyonlarını belirleyin. Şimdi, CG one strain syngen'e enjekte edilmek üzere DNA'yı 60 nanograms per microliter nihai konsantrasyona seyreltin. Zebrafish embriyolarına 250 nanoliters 30 nanograms per microliter rag two CM ve 30 nanograms per microliter enjekte edin.

İki GFP'yi, DNA'yı doğrudan hücreye, sarı keseye değil olacak şekilde dikkatle hedefleyerek tek hücre evresindeki zebrafish embriyolarına enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları 28.5 °C'de saklayın ve 24 saat sonra ölü embriyoları uzaklaştırın; beş günlük yaşam süresinin sonunda, enjeksiyondan yaklaşık 28 gün sonra hayvanları büyük tanklara aktarın. Bir Petri kabındaki 25 mL balık sistem suyuna 200 µL 4 ng/mL trica S ekleyerek larval zebrafish'leri anestezi edin.

GFP floresansını tespit etmek için bir epi-floresan mikroskobu kullanarak larvaları floresan işaretli TALL gelişimi açısından inceleyin. Analizde hiçbir lösemili balığın atlanmadığından emin olmak için tümör pozitif larvaları negatif olanlardan ayırın. Negatif larvalar, tümörlerin daha fazla büyümüş olabileceği daha sonraki bir zaman noktasında tekrar incelenebilir. Tümör büyümesini takip etmek için floresan işaretli lösemili balıkları epi-floresan mikroskobu kullanarak haftada en az bir kez izleyin.

GFP pozitif lösemi hücreleri hayvanın %50'sinden fazlasını kapladığında, balığı sakrifiye etmek için dokuz mililitre balık sistem suyu içeren bir Petri kabına bir mililitre dört nanogram/mililitre Trica S ekleyin; ardından balığı, 0.9 XPBS içinde %5 fetal bovine serum içeren bir mililitre çözelti bulunan yeni bir Petri kabına yerleştirin, balığı bir jiletle masere edin ve büyük hücre kümelerini dağıtmak için karışımı pipetleyin. Son olarak, hücreleri 40 µm'lik bir ağ süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücrelerden 500 µL'yi dört mililitrelik bir polistiren tüpe pipetleyin. Ölü hücreleri işaretlemek için 1 mg/mL konsantrasyonunda 1 µL peridinyum iyodür ekleyin, vorteksleyin ve ardından hücreleri buz üzerinde muhafaza edin. Ayrıca, transplantasyon sırasında tümör hücreleri için taşıyıcı görevi görecek normal kan hücrelerini toplamak amacıyla, 50 mililitrelik tüpe toplam hacim beş mililitre olacak şekilde 0.9 X PBS içinde %5 FPS'den 4 mL ekleyerek bir wild type CG1 balığı hazırlayın.

Normal kan hücrelerini 0.9 x pbs içinde %5 FBS ile mililitre başına 3 x 10⁵ hücre olacak şekilde seyreltin ve ardından bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 100 µL pipetleyin. Floresan aktive hücre ayıklayıcı (FACS) kullanarak, GFP pozitif PI negatif tümör hücrelerini, belirtilen dozlarda kan hücreleri içeren 96 kuyucuklu plakaya ayıklayın. Ek olarak, normal kan hücresi bulunmayan bir kuyucuğa 10.000 hücre ayıklayın ve ayıklanan hücrelerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için FACS ile yeniden analiz edin. Hücreleri çöktürmek için 96 kuyucuklu plakayı 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatandan 95 µL uzaklaştırın ve hücreleri kalan 5 µL içerisinde tekrar süspande edin. Hücre süspansiyonunu, 26,5 gauge bir mikro şırınga kullanarak 60 günden büyük yetişkin syngeneic zebra balıklarının periton boşluğuna enjekte edin. Transplantasyon öncesinde zebra balıklarının anesteziye alınmasına gerek yoktur.

Transplantasyonun yaklaşık 28 gün sonrası; 45 balığa 10 lösemi hücresi, 20 balığa 100 hücre, yedi balığa 1000 hücre ve beş balığa 10,000 TALL hücresi nakledin. GFP floresansını tespit etmek için alıcı zebra balıklarını, 4 85 20 eksitasyon dalga boyu ve 5 30 25 emisyon filtresi kullanarak bir epifloresan mikroskop ile inceleyin.

Enjekte edilen toplam balık sayısına oranla pozitif balık sayısını kaydedin. Balıkları 90 güne kadar her 14 günde bir yeniden inceleyin ve pozitif balık sayısını kaydedin. Tümör pozitif balıklar daha yaygın hale geldiğinde.

Hayvanı trica US aşırı dozu ile sakrifiye edin, sonuçları bir tabloya girin ve primer TALL CG one suşu içindeki kendini yenileyen lösemi hücrelerinin frekansını belirlemek için verileri web tabanlı ekstrem sınırlayıcı dilüsyon analiz yazılımına yükleyin; embriyolar RAG two cmic ile enjekte edilmiş ve RAG two GFP larvaları primer TALL için taranmıştır. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, 28 gün sonra enjekte edilen balıkların yaklaşık %5'inin timusunda GFP pozitif T hücreleri bulunur ve bu balıkların %100'ünde lösemi gelişir. Burada, floresanla işaretlenmiş TALL hücreleri 65 günlük hasta hayvanlardan ayrıştırılmış ve sınırlayıcı dilüsyon hücre transplantasyon analizinde kullanılmıştır. İlk olarak, tek hücreleri seçmek için bir kapı (gate) çizilmiştir.

Ardından propidyum iyodür negatif hücreler seçildi. Ve son olarak, ayıklama işlemi için yalnızca GFP pozitif lösemi hücrelerini seçmek amacıyla bir kapı (gate) çizildi. TALL nakledilmiş balıkların 28. günündeki bu örneğinde, erken evre tümörler enjeksiyon bölgesinin yakınındaki GFP pozitif hücre alanları şeklinde görüldü.

Bazı TLS'ler bu deneyler için periton boşluğunu dolduracak şekilde genişleyerek daha fazla ilerlemiş olsa da, tek bir kişi tarafından birkaç saat içinde kolayca gerçekleştirilebilen bir işlemle 220'den fazla hayvana transplantasyon yapılmıştır. elda yazılımı kullanılarak yapılan veri analizi, ortalama her 135 T tüm hücresinden birinin kendi kendini yenileyebilen lösemi yayıcı hücre olduğunu göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tümör hücrelerinin sınırlayıcı dilüsyonla syngenetic zebra balıklarının periton boşluğuna nasıl transplant edileceği ve elde edilen verilerin belirli bir tümör içindeki tümör yayıcı hücrelerin frekansını belirlemek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanıldığı daha ileri çalışmalar, bu tümör yayan hücrelerin kendi kendini yenilemesini yöneten mekanizmaların belirlenmesine yardımcı olabilir.