CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerden yeni hasat edilmiş dokulardaki kırmızı hücre öncüllerini doğrudan tanımlamaktır. Bu, bu farelerdeki eritropoetik sistemin değişim geçirdiği dönemlerde, öncüllerin moleküler özelliklerini incelememize olanak tanır. Örneğin, embriyonik gelişim sırasında veya hipoksik strese verilen yanıt sırasında, önce fare fetal karaciğerinden veya yetişkin dalak veya kemik iliğinden hematopoetik doku izole edilir ve tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır.

Ardından hücreler, hücre yüzey belirteçleri CD 71 ve TER one 19'e karşı antikorlarla ve örneğin hücre sağkalımını veya hücre döngüsü durumunu ölçmek için ilgilenilen diğer belirteçlerle işaretlenir; işaretli hücre süspansiyonu daha sonra bir akış sitometrisi analizörü kullanılarak analiz edilir ve olgunlaşmanın farklı aşamalarındaki spesifik eritroblast alt kümeleri tanımlanır. Bu spesifik alt kümeler, hücre ayıklama yöntemiyle saflaştırılabilir. Sonrasında, her bir eritroblast olgunlaşma alt kümesi için hücresel ve moleküler analizler gerçekleştirilebilir.

Taze izole edilmiş hematopoetik dokularda, belirli olgunlaşma aşamalarındaki eritroblastların doğrudan tanımlanabilmesi, hücrelerin fizyolojik kortekste incelenmesine olanak tanır. Bu nedenle, söz konusu yöntem farklı olgunlaşma aşamalarındaki yüksek eritroblastların in vivo yanıtlarını incelememize imkan verir. Fareler çeşitli uyarılara maruz kaldığında, eritropoetik hızı artırırlar.

Örneğin, yüksek rakımı taklit eden hipoksik koşullar veya eritropoietin hormonunun enjeksiyonu. Karmaşık bir doku ortamı içindeki blastları tanımlamak ve aynı zamanda bunların sinyal iletimi, sağkalım ve hücre döngüsü durumlarını incelemek için çok parametreli akış sitometrisi kullanıyoruz. Ayrıca, eritroblastları spesifik olgunlaşma evrelerine göre doğrudan taze dokudan ayrıştırabilir ve bunların gen ekspresyon seviyelerini, kromatin durumlarını veya diğer moleküler fonksiyonlarını araştırabiliriz.

Farelerde definit eritropoez, yetişkin farenin dalak ve kemik iliğinde gerçekleşir. Bu nedenle, söz konusu dokular ötanazi uygulanmış bir fareden toplanacaktır. Fareye ötanazi uygulandıktan sonra, kardiyak ponksiyon yoluyla EDTA veya heparinli kan toplama tüplerine kan çekin; bu kan daha sonra hematokrit sayımı, retikülosit sayımı veya CBC analizi için kullanılacaktır.

Hasat edilen dalak ve femur kemiğini, soğuk boyama tamponu içeren ayrı tüplere yerleştirin. Arzu edilirse, hasat edilen dokuları buz üzerinde tutun. Dalağı tartın.

Eritropoetik stres tepkimesi geçiren farelerde dalak ağırlığında belirgin bir artış görülmesi muhtemeldir. Ardından, hasat edilen dokulardan, daha önce fare embriyosu üzerinde gösterilen prosedürler uygulanarak dalak hücreleri ve kemik iliği hücreleri hazırlanır. Definitif eritropoez, embriyonik 12,5 ve 15,5 günler arasında fetal karaciğerde gerçekleşir.

Gebeliğin 12,5 ila 14,5. günlerinde fetal karaciğer hücreleri elde etmek amacıyla zaman ayarlı gebe dişi fareler hazırlanır. Zaman ayarlı gebe dişi fareler ötanize edilir ve uterus boynuzları buz içeren bir Petri kabına alınır. Soğuk kültür medyumu veya boyama tamponu kullanılır.

Embriyonik gün 12.5 veya daha genç dönemlerdeki fetüs karaciğerlerini diseke etmek ve embriyoları uterustan çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu gereklidir. İlk olarak, her bir boncuğu kornudan ayırın. Ardından, amniyotik kesesi içindeki embriyoyu serbest bırakmak için uterus duvarını nazikçe eksize edin.

Amniyotik membranı nazikçe soyun. Fetal karaciğer, çok daha küçük bir kalbin altında yer alan, karındaki en büyük kırmızı dokudur. Fetal karaciğeri diseke etmek için, pens yardımıyla embriyoyu karaciğerin her iki yanından sabitleyin ve karaciğeri karnın dışına, besiyerine doğru nazikçe itin.

Karaciğeri, taze boyama tamponu içeren bir tüpe nazikçe aktarın. Tüm fetal karaciğerler diseke edilip taze boyama tamponu içeren bir tüpe aktarıldıktan sonra, karaciğerleri pipetleme yoluyla mekanik olarak ayrıştırın; ardından ayrıştırılmış hücreleri 40 mikronluk bir naylon ağ süzgeçten filtreleyin, hücreleri santrifüjle iki kez yıkayın, süpernatanı uzaklaştırın ve boyama tamponu içinde yeniden süspande edin.

İkinci yıkamadan sonra, hücreleri tripan mavisi ile boyayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. E 13.5 evresindeki bir fetal karaciğerde yaklaşık 10⁷ hücre bulunur. Akış sitometrik analiz için hücreleri, 200 µL örnek başına 1 ila 2 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.

Bu video protokolü kapsamında, akış sitometrisi için antikor boyaması yalnızca fetal karaciğer hücreleri üzerinde gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için; fare hücrelerindeki FC reseptörlerini bloke etmek üzere saflaştırılmış tavşan IgG, CD 71 FETR one 19 PE ve hücre yüzey proteini fast'e yönelik bir antikor içeren bir primer antikor boyama ön karışımı hazırlayın. Antikor solüsyonunu, tüpü iki ila üç kez ters çevirerek nazikçe karıştırın; daha önceden hazırlanmış fetal karaciğer hücresi örneğine 200 µL primer antikor boyama ön karışımı ekleyin ve hücreleri yeniden süspansiyona getirmek için pipetle nazikçe aşağı yukarı çekin.

Ardından, şu altı kontrol hücre örneğini hazırlayın. Hücrelerin, hücrelerin arka plan otofloresansını sağlamak amacıyla boyama tamponunda bırakıldığı boyanmamış bir örnek; kanallar arasındaki spektral çakışmayı düzeltmek için protokolde kullanılan her bir antikor veya renk için tek renkli kontroller (bu deneyde bunlar TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin ve streptavidin A PC'dir) ve fast biotin için, hücrelerin fast biotin dışındaki tüm renkler veya antikorlarla boyandığı ve bu kanal için gerçek arka planı sağlayan bir floresans eksi bir (FMO) kontrolü. Örneği ve ilgili kontrolleri, birincil antikor boyamasında buz üzerinde, karanlıkta 45 dakika ile bir saat arasında inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, her bir örnek tüpüne üç mililitre boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve dört derece celsius sıcaklıkta, yaklaşık 400 ×g hızda üç ila beş dakika santrifüjleyin. Ardından, PC içinde strep avid uygulayın ve tüpleri buz üzerinde 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, hücreleri ilk antikor boyamasında olduğu gibi yıkayın.

Son olarak, hücreleri, ölü hücreleri dışlamak için hücreye geçirgen olmayan DNA boyası seven-a-a-d içeren boyama çözeltisinde yeniden süspande edin. Örnekler artık akış sitometrisi analizi için hazırdır. Bu prosedürün en zor kısmı, eritroblast alt kümelerinin güvenilir şekilde tanımlanmasını sağlayan akış sitometrik olayların doğru kapılama analizidir.

Bu işlem; cihazın dikkatli bir şekilde kurulmasını, tüm kontrol örneklerinin doğru şekilde hazırlanmasını, spektral örtüşme için dikkatli bir kompanzasyon yapılmasını ve ardından ölü hücreleri, agregatları ve çok küçük olayları dışlayan bir kapılama (gating) işlemini gerektirir. Veri analizinin başlangıcında, her renk kombinasyonu için spektral örtüşme kompanzasyonunu ayarlamak amacıyla boyanmamış örnek ve tek renkli kontrol örnekleri kullanılır.

Bu örnekte, Fit C floresansının PE kanalına nasıl sızdığını ve bu spektral örtüşmenin kompanzasyon sonrası nasıl düzeltildiğini göstereceğiz. Öncelikle, boyanmamış kontrolü kullanarak Fit C pozitif ve PE negatif bir bölge tanımlıyoruz. Ardından, Fit C tek renk kontrolünü kullanarak PE kanalındaki spektral sızıntıyı görselleştirebiliriz.

FlowJo yazılımı ile dijital kompanzasyon yapıldıktan sonra, PE kanalındaki spillover fit E sinyali minimize edilir. Kompanzasyon sonrası ölü hücreler, agregatlar ve küçük olaylar uzaklaştırılabilir. Agregatlar ve hücre dubletleri, ileri saçılma (forward scatter) yüksekliğine karşı ileri saçılma alanı grafiği çizilerek ve dar bir diyagonal kapı içindeki olaylar seçilerek uzaklaştırılır.

Ölü hücreler, hücre geçirgen olmayan bir DNA boyası olan dapi için negatif olan hücrelerin seçilmesiyle uzaklaştırılır. DAPI negatif canlı hücre kapısı (gate), aynı zamanda çok düşük ileri saçılma (forward scatter) değerine sahip olan çekirdekler veya debris gibi çok küçük olayları da hariç tutar. Ardından, fetal karaciğer hücreleri için kapılama stratejisini göstereceğiz.

Yeni hasat edilmiş hücreler CD 71 TUR one 19 ve eritroid olmayan soy hattı belirteçlerine yönelik ZI işaretli antikor kokteyli ile işaretlendi. Bu örnekte, numuneler spektral örtüşme için halihazırda kompanse edilmiş ve ardından agregatlar, ölü hücreler ve çok küçük olaylar dışlanacak şekilde kapılanmıştır. Soy hattı pozitif fitzy boyaması hariç tüm renkleri içeren FMO numunesini, bir fitzy histogramı çizmek ve soy hattı negatif hücre kapısını tanımlamak için kullanırız; ardından bu kapıyı, ZI konjuge soy hattı belirteçleri ile boyanmış fetal karaciğer hücresi numunesine uygularız.

Lineage negatif hücreler seçilir ve Y ekseninde CD 71 ve X ekseninde TER 19 ile grafiklenir. Hücreler artık S0 ile S5 arasındaki alt kümelere ayrılmaya hazırdır. Lineage temizlenmiş S0 alt kümesi, büyük ölçüde EPO bağımlılığı başlamadan önceki CFUE potansiyeline sahip hücreleri içerir.

S bir alt kümesi, büyük oranda hücre döngüsünün S evresinde olan EPO bağımlı CFUE hücrelerini içerir. S iki alt kümesi hücreleri, koloni oluşturma potansiyelini kaybetmiştir ve hemoglobin eksprese etmeye başlamaktadır; S üç alt kümesi hücreleri ise büyük oranda bazofilik eritroblastlardır. S dört ve S beş alt kümeleri geç evre eritroblastları içerir. Burada, CD 71 ve TER one 19'a yönelik antikorlarla işlenmiş ve işaretlenmiş dalak hücrelerinden elde edilen veri kazanımını takiben uygulanan analiz stratejisi ile ölüm reseptörü fast histogramı gösterilmektedir.

Birincisi, diyagonal kapının dubletleri veya daha büyük agregatları hariç tutarak muhtemelen tek hücreler olan olayları temsil ettiği tüm edinilmiş olayları gösterir. Bu kapıdaki hücreler, burada histogram ikisinde daha ayrıntılı olarak analiz edilir. Muhtemelen çekirdek veya döküntü olan çok küçük olaylar hariç tutulur.

Kapıdan geçirilmiş hücreler, membran geçirgenliği yüksek apoptotik hücreler olması muhtemel DAPI pozitif hücrelerin sonraki analizlerden hariç tutulduğu üçüncü histogramda gösterilmiştir. Dördüncü histogram, canlı dalak hücrelerinden oluşan sonuç popülasyonunu göstermektedir. Pro eGate; CD 71 yüksek, TER one 19 orta düzeydeki hücreleri içerir; tur R one 19 yüksek hücreler beşinci histogramda daha ayrıntılı olarak analiz edilmiştir.

Burada, CD 71 yüksek hücreleri; daha az olgun olan geniş alanlı a eritroblastlarına ve daha küçük, daha olgun A B eritroblastlarına ayrılmıştır. En olgun eritroblast alt kümesi ARI C'dir. Hücre yüzey proteinlerinin ekspresyonu, ilgili antikorlar TER R 19 ve CD 71 ile aynı anda eklenerek bu alt kümelerin her biri için eş zamanlı olarak ölçülebilir. Boyama histogramı altı, bazal durumdaki farelerde ve tek doz E ppo enjekte edilen farelerde, özellikle alan A alt kümesinde, ölüm reseptörü fast'ın hücre yüzeyi ekspresyonunu göstermektedir.

Sonuçlar, EPO'nun bölgedeki hızlı ekspresyonu baskıladığını göstermektedir. Her bir alt kümedeki hücreler için hücre içi proteinlerin in vivo ekspresyonu veya hücre döngüsü durumu da ölçülebilir. Bu temsili hücre döngüsü analizinde, farelere intraperitonal olarak BRDU enjekte edilmiş ve 30 ila 60 dakika sonra kemik iliği hasat edilmiştir.

Hücreler CD 71 ve TER one 19'a boyanmasının yanı sıra, replike olan DNA'larına BRDUya dahil edilme durumuna göre de boyanmıştır; BRDU pozitif hücreler döngünün S-fazındadır. İnterfaz hücreleri BRDU negatiftir ve G one veya G two M fazlarına ayrılabilir. DNAD seven A A D kullanılarak hücreler, PRO E area A A B ve A EC alt kümelerinin her birinden ayrıştırılabilir.

Burada, hücre boyutunun küçülmesi, nükleer kondansasyon ve hemoglobin ekspresyonunu yansıtan kahverengi renklenmenin artmasıyla seyreden ardışık olgunlaşmayı gösteren sitozin preparatları sunulmuştur. Son olarak, E 13.5 fetal karaciğerindeki S3 alt kümesinin temsilci bir hücre döngüsü analizi burada gösterilmiştir. Gebe farelere BRDU enjekte edilmiştir.

Fetal karaciğerler hasat edildikten 30 ila 60 dakika sonra tespit edildi, permeabilize edildi ve CD 71, TER one 19 ile BRDU'ya karşı antikorlarla boyandı. S-fazı hücrelerinin BRDU pozitif olduğu durumda S3 hücrelerinin hücre döngüsü durumu analiz edildi ve DNA içeriği, DNA boyası seven A a d ile boyanarak nicelendirildi.

Tanımladığımız sitometrik yaklaşım; hücre yüzeyi belirteçleri ve diğer proteinlerin ekspresyonu, hücre sağkalımı, fosfo-spesifik antikorlar kullanılarak hücre sinyalizasyonu ve hücre döngüsü durumu gibi hücresel fonksiyonların eş zamanlı olarak incelenmesine olanak tanır. Bu sayede, farklı bir olgunlaşma evresi olan eritroblastların geniş bir yelpazedeki stimuluslara karşı moleküler yanıtlarını veya genetik mutasyonların etkisini araştırmamıza imkan sağlar. Akış sitometrisi ile belirlenen olgunlaşma alt kümelerinin, hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu ve ileri saçılım (forward scatter) temelinde tanımlandığı belirtilmelidir.

Genel olarak, her bir alt kümedeki hücrelerin çok çeşitli fare modellerinde benzer morfolojik eritroblast aşamalarına karşılık geldiğini saptadık. Bununla birlikte, yeni bir fare modeli incelenirken bunun doğrulanmasını öneririz. Her bir alt kümedeki hücreler sıralanarak morfolojileri incelenebilir; ayrıca her alt kümeden hücreler RNA veya transkriptom analizi için de sıralanabilir; sıralama deneylerinde, hücreler üzerindeki makaslama stresini en aza indirmek için düşük sıralama basınçları ve geniş nozullar kullanılmalıdır.

Ayrıca, her ayıklama deneyi sonrasında hücre saflığının ve canlılığının kontrol edilmesini öneririz. Son olarak, belirli bir alt kümenin frekansında bir değişim tespit edildiğinde, bunun söz konusu alt kümedeki hücre sayısındaki gerçek bir değişimden mi yoksa diğer alt kümelerdeki değişimlerden mi kaynaklandığını belirlemek önemlidir. Bu nedenle, alt küme frekanslarını ölçmenin yanı sıra, her bir alt kümedeki hücrelerin mutlak sayısını da ölçmek her zaman gereklidir.