Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, basit bir protokol kullanarak polio virüsü izolatlarını hızlı bir şekilde tanımlamaktır. Bu analiz için, insan poliovirüs reseptörünün hücre dışı alanını içeren ve IgG iki fc'ye bağlı kimerik moleküllerle kaplanmış duyarlı jelatin partikülleri kullanıyoruz. Bu partiküller, tüm poliovirüs izolatı serotipleri için tekdüze bir afiniteye sahip olduğundan, herhangi bir insan poliovirüsü içeren örneklerle inkübe edildiğinde partiküllerin aglütinasyonu gerçekleşir.

Buna karşın, örneği izole edilen spesifik virüsü tanıyabilen antikorlar mevcutsa nötralizasyon gerçekleşir ve aglütinasyonu önler; bu deneysel sistem kullanılarak poliovirus izolatlarının hızlı tanımlaması tek aşamalı bir reaksiyonla gerçekleştirilebilir. Geleneksel nötralizasyon testleri gibi mevcut yöntemlerin yanında bu tekniğin temel avantajı, iş gücünü azaltmayı, işlemleri hızlandırmayı ve sonuç alma süresini kısaltmayı amaçlayan prosedür ve yorumlama basitliğidir. Anti PV 1, PV 2 ve PV 3 antikorlarını yeniden çözmek için her bir şişeye 0,5 ml su ekleyin.

Ardından, her bir antikor çözeltisini 4,5 mililitre bakım ortamı içeren ayrı tüplere aktarın. Bazı anti PV antikoru lotları, yeniden konstitüe edilmiş formda sağlanmaktadır; bu tür anti PV antikoru lotları için su ekleyerek yeniden konstitüasyon yapılmasına gerek yoktur.

Ardından, yeni etiketlenmiş tüplerde, toplam hacmi 3,6 mililitre olacak şekilde kombine antikor çözeltilerinin bire bir karışımlarını hazırlayın. Örneğin, 1,8 mililitre anti PV bir ile 1,8 mililitre anti PV ikiyi karıştırın. Anti PV bir artı PV iki kombinasyonu hazırlamak için, bunu mümkün olan her ikili kombinasyon için tekrarlayın ve ayrıca her bir antiserumdan 1,2 mililitre karıştırarak her üç antikor türünü de içeren bir çözelti hazırlayın.

Dört karışım hazırlandıktan sonra, her antikor çözeltisine 720 µL FCS eklenir. Bu işlem, analiz sırasında antikorlar tarafından jelatin partiküllerinin meydana getirdiği non-spesifik aglütinasyonu azaltmaya yardımcı olacaktır. Antikor havuzları, aglütinasyon analizinde kullanılana kadar -20 °C'de saklanabilir.

Bu analizde, insan poliovirüs reseptörünün hücre dışı bölgeleri ve IgG2 fare FC bölgeleri ile kaplanmış liyofilize jelatin partikülleri kullanıyoruz. Aglütinasyon görüntüsünün tutarlılığını sağlamak için tek bir deneyde farklı lotlar değil, tek bir lot partikül kullandığınızdan emin olun; partikülleri her şişe için 1,5 milliliters reconstitution buffer ile yeniden süspanse edin. İyice karıştırmak için hafifçe vurun.

Yeniden konstitüe edilen partiküller, dört °C'de iki haftaya kadar saklanabilir. İlk olarak, deneyinizi 96 kuyucuklu bir mikrotitre plaka üzerinde tasarlayın. Her örnek için, birinci kuyucuk yalnızca virüs içerecektir.

İki ile beş arasındaki kuyucuklar, virüsü ve dört karma antikor çözeltisinden birini içerecektir. Virüs veya antikor içermeyen, yalnızca besiyeri içeren bir negatif kontrol için bir kuyucuğu ayırdığınızdan emin olun. Plaka kurulumu tamamlandıktan sonra, iki ile beş arasındaki satırlardaki her bir kuyucuğa 12 µL uygun antikor çözeltisi ve 12 µL büyüme besiyeri ekleyin.

Sadece virüs içeren ortama, birinci sıradaki kuyucuklara ve altıncı sıradaki negatif kontrol kuyucuğuna ekleyin. Ardından, ilk beş sıradaki kuyucuklara 12 µL virüs örneği ve altıncı sıradaki negatif kontrol kuyucuğuna 12 µL büyüme ortamı ekleyin. Antikorlar ve virüs plaka üzerine eklendikten sonra, yeniden oluşturulan jelatin partiküllerini hafifçe vurarak süspande edin ve hemen tüm kuyucuklara kuyucuk başına 25 µL partikül ekleyin.

Her bir kuyucukta eşit miktarda partikül elde edebilmek için, partikülleri plağa aktarmadan önce çökmelerine izin vermemek önemlidir. Deney plağını bir plak karıştırıcıya yerleştirin ve 30 saniye boyunca karıştırın. Ardından plağı beyaz bir kağıt üzerine koyun ve aglütinasyonun gerçekleşmesi için plağı oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.

Oluşan aglütinasyon kararsız olduğu için inkübasyon sırasında veya sonrasında plakayı hiçbir zaman hareket ettirmemek önemlidir. Reaksiyon gerçekleştikten sonra, her kuyucuktaki aglütinasyon kalitesinin değerlendirilebileceği şekilde plakanın birkaç fotoğrafını çekin. Aglütinasyonun gerçekleşmediği kuyucuklarda, burada solda gösterildiği gibi renkli jelatin partikülleri kuyucuğun dibine çökecektir; aglütinasyonun gerçekleştiği kuyucuklarda ise durum farklıdır.

Virüs ve pvr arasındaki etkileşim nedeniyle, IgG iki A kaplı jelatin partiküllerinde merkezde gösterildiği gibi yaygın bir renk paterni görülmektedir. Bu deneyde, PV bir, iki ve üç virüs çözeltilerinin antikor varlığında glu indükleme yeteneğini test ettik. Virüs veya antikorların yokluğunda burada gösterilen kombinasyonlarda aglütinasyon gerçekleşmez ve jelatin partikülleri çöker; buna karşılık virüs içeren ancak antikor içermeyen kuyucuklarda durum farklıdır.

Virüsün etkileşimi nedeniyle aglütinasyon gerçekleşmiştir. Deney kuyucuklarındaki PVR IgG ile kaplı jelatin partiküllerinin bulunduğu durumda, belirli bir virüsü spesifik olarak nötralize eden antikorlar içeren herhangi bir kuyucukta virüslerin aglütinasyonu önlenir. Örneğin, anti PV 1 antikorları içeren kuyucuklarda poliovirüs tip 1'in aglütinasyonu önlenirken, sadece anti PV 2 ve anti PV 3 antikorları içeren kuyucuklarda önlenmez.

Aynı durum poliovirüs tip iki ve üç için de geçerlidir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yürütülürse üç saat kadar kısa bir sürede tamamlanabilir.