Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro ve in vivo uygulamalar için sodyum nanosensörler üretmektir. Bu işlem, nanosensörler için sensör bileşenlerini içeren bir opto karışımı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, opto eklendiğinde nanosensör oluşumuna olanak sağlamak amacıyla, homojen bir dağılım için sürfaktan sulu çözelti içinde sonikasyona tabi tutulur.

Ardından, çözelti içinde nanosensörleri oluşturmak için opto karışımı, sonikasyon altında sulu sürfaktan karışımına eklenir. Bu video, sensör yanıtının ayarlanabilir olduğunu göstermektedir. Sensörler, kardiyak miyositlere mikroenjeksiyonla aktarılabileceği gibi, farelere deri altı şeklinde de enjekte edilebilir.

Bu tekniğin floresan indikatör boyalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sensörleri fizyolojik ortama uygun bir dinamik aralığa ayarlayabilmemiz, daha geniş bir analit yelpazesini ölçebilmemiz ve kantitatif analiz için rasyometrik ölçümler gerçekleştirebilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sensörler üretildikten sonra bunları biyolojik bir ortama yerleştirme aşamasında zorluk yaşayabilirler. Opto üretimine geçmeden önce, yazılı protokol uyarınca kuru sodyum iyonu four x, kuru sodyum TFPB ve chromo four three stokları hazırlanmalıdır.

Bir çeker ocak içerisinde, tüm malzemeleri 1,5 mililitrelik bir cam viyale aktarın. Teflon kaplı vidalı bir kapak kullanarak, tüm PVC çözünene kadar viyali hafifçe vorteksleyin. Çözeltinin kırmızı renkte görünmesi gerekir.

4 g'lık bir cam şişeye 10 mg/mL PEG lipid'den 100 µL ekleyerek nanosensörlerin hazırlanmasına başlayın. Ardından, 10 mM HEPES gibi istenen sulu çözeltiden 4 mL ekleyin.

Bir laboratuvar krikosu kullanarak sonikasyon ucunu flakona yedi milimetre derinliğe kadar daldırın ve 30 saniye boyunca düşük sonikasyon gücü uygulayın. Eşit karışım sağlamak için bir pipet yardımıyla 0,6 mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre optik materyal ile 50 mikrolitre diklorometanı birleştirin. Ardından, üç dakikalık bir sonikasyon işlemi başlatın.

Sonikasyon başladığında, pipet ucunu daldırarak ve tüm hacmi tek bir hızlı, eşit enjeksiyonla boşaltarak 100 µL opto karışımı ekleyin. pH yediye yükselirse ve çözeltideki kalıntı THF ve diklorometanı uzaklaştıracak sodyum yoksa çözelti maviye dönecektir. Sonikasyon ucunu iki milimetre derinliğe getirin.

Kalan üç dakika geçtikçe çözelti opaklaşacaktır. Sonikasyon tamamlandığında, Nanosensör çözeltisini beş mililitrelik bir şırıngaya çekin. Bir filtre takın ve nanosensör çözeltisini vidalı kapaklı bir cam şişeye aktarın.

Nanosensörün hassasiyetinin ölçülebileceği, sodyum konsantrasyonu kademeli olarak artan 10 çözelti hazırlayarak başlayın. Sıfır molar ve bir molar sodyum stok çözeltilerini 50 mililitrelik konik tüplerde birleştirin. Ardından, optik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada, her sodyum konsantrasyonundan 100 mikrolitreyi bir sütundaki üç kuyucuğa ekleyin.

Ardından, her bir kuyucuğa taze hazırlanmış 100 µL nanosensör ekleyin, plakayı bir mikroplaka florimetresine yerleştirin ve kullanılan kromofor için ideal olan eksitasyon, emisyon ve kesme (cutoff) dalga boylarını girin. Ölçülen dalga boylarının seçimi uygulamaya bağlıdır. Bu dalga boyları, hücre içi hızlı dinamik ölçümler veya gürültü azaltma imkanı sağlar.

Alfa değerlerini elde etmek için, 570 nanometredeki yoğunluğun 670 nanometre veya 680 nanometredeki yoğunluğa oranını hesaplayın. Alfa değerlerini, sodyum konsantrasyonunun logaritmasına karşı grafiğe dökün. Sıfır sodyum konsantrasyonunun logaritmasını eksi bir olarak belirleyin.

Şimdi yanıta sigmoid bir eğri uydurun ve bu eğriden, alfa değerinin 0.5 olduğu sodyum konsantrasyonunu hesaplayın. Bu, sensörün optimal şekilde yanıt verdiği sodyum konsantrasyonunu temsil eder. Bu bilgiyi kullanarak, optimal sodyum konsantrasyonuna sahip nanosensörler oluşturmak için opto içindeki sodyum iono four x sodyum TFPB ve chromo iono four three oranını ayarlayın.

Örneğin, yalnızca dört 10 sodyum miktarının farklı olduğu, farklı opto formülasyonlarını temsil eden beş farklı nanosensör setinin hero yanıt eğrileri. Hücre içi görüntüleme için, hücre ortamını Tyro çözeltisi gibi şeffaf bir ortamla değiştirin ve hücreleri bir görüntüleme haznesine aktarın. Şimdi, çekilmiş bir cam pipeti, suda beş miligram/mililitre glikoz ile hazırlanmış nanosensör çözeltisiyle geri doldurun.

Ardından pipeti bir mikro manipülatöre monte edin ve basınç kontrollü bir enjeksiyon sistemine bağlayın. Pipeti hücrenin üzerine ve sitoplazmanın içine doğru indirin. Membranı delmek için manipülatör tutucusuna hafifçe vurmak bazen gerekli olabilir.

Birkaç yüz picoliter nanosensör çözeltisi enjekte edin ve pipeti hızla geri çekin. Bir anestezi odası kullanarak isoflorine ile bir CD1 çıplak fareyi anestezi altına alın. Fare anesteziye girdiğinde, fareyi dezenfekte edilmiş görüntüleme odasına yerleştirin.

Ardından, steril 31 gauge bir insülin şırıngasını, 10 millimolar PBS içinde uygun KD değerine sahip 10 µL nanosensör ile doldurun. Pens kullanarak tüm hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun. Fareyi tutarken, istenen enjeksiyon bölgesinde farenin sırtı boyunca küçük bir deri katı tutun.

Şırıngayı, eğimli ucu yukarı bakacak ve iğne cilde paralel olacak şekilde cilde yerleştirin. Ardından, iğnenin bir kan damarına girmediğinden emin olmak için şırınga pistonunu geri çekin. Geri basıncı en aza indirmek için, cilt içinde bir cep oluşturacak şekilde iğneyi nazikçe sağa ve sola hareket ettirin.

Ardından sensörleri enjekte edin ve şırıngayı nazikçe çıkarın. Enjeksiyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın ve enjeksiyon bölgesinden sızmış olabilecek herhangi bir solüsyonu silin. Genellikle sırt boyunca eşit aralıklarla altı enjeksiyon yapılır.

Farklı farelerde uygulama yapılıyorsa, hastalık bulaşmasını ve çapraz kontaminasyonu minimize etmek için iğneyi değiştirin. Enjeksiyonların ardından, nanosensörlerin eksitasyon emisyon spektrumuyla yakından eşleşen filtre setlerini kullanarak parlak alan ve floresan görüntüler elde edin. Bu işlem aynı zamanda cildin otofloresansını da minimize eder.

Bu neonatal kardiyak miyositler bir lam üzerine kültüre edilmiş ve sodyum nanosensörleri ile enjekte edilmiştir. Bu floresan görüntü, 639 nanometre uyarım dalga boyunda alınmıştır. Bu, aynı hücrelerin parlak alan görüntüsüdür ve bu da ikisinin üst üste bindirilmiş halidir.

Bazı sensör kümelenmeleri meydana gelmiş olsa da hücreler normal morfolojiye sahiptir. Sensörler sitozol boyunca yayılmış olup nükleer yükleme görülmemektedir. Aydınlık alan ve floresan görüntünün bu üst üste bindirilmiş hali, çıplak bir fareyle deri altı boşluğuna yapılan dokuz farklı sodyum nanosensör deri altı enjeksiyonunu göstermektedir.

Masten nano-sensörlerin fabrikasyonu, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde dakikalar içinde tamamlanabilir ve tersinir gerçek zamanlı analit akışını ölçmek için herhangi bir araştırmaya uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik bir ortamda kantitatif ölçümler yapmak için nano-sensörlerin hücre içi veya deri altı boşluğa nasıl yükleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.