Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Bu prosedürün genel amacı, melanosit, melanoma ve cilt kök hücresi biyolojisi çalışmalarında kullanılmak üzere 3 boyutlu bir insan cilt rekonstrüksiyonu oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle doku kültürü tepsisi eklerinin nötralize sığır kolajeni ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, fibroblastlar ve kolajen kullanılarak hücresel dermal kompartımanın oluşturulmasıdır.

Ardından, keratinositlerin melanositler veya melanoma hücreleri ile karıştırılmasıyla epidermal kompartıman oluşturun. Prosedürün son adımı, 18. günde bir deri rekonstrüksiyonu hasat etmek ve bu deri rekonstrüksiyonunu bir fareye greftlemektir. Nihayetinde, greftin immünohistokimyasal ve immünofloresan analizleri; melanosit içeren normal deri mimarisini, normal kök hücrelerin migrasyonunu ve diferansiyasyonunu ve evreye özgü melanoma fenotiplerini göstermektedir.

Normal melanositlerin veya melanoma hücrelerinin bir kapta kültüre edildiğinde, doku bağlamındaki hücrelerden çok farklı davrandığını çalışmalarımızın erken aşamalarında fark ettiğimiz için 20 yıl önce cilt rekonstrüksiyon modelini geliştirdik. Bu nedenle, cilt rekonstrüksiyon modeli, hücrelerin cildin bir kompartımanından diğer herhangi bir yere nasıl hareket ettiğini görmemiz için idealdir. Önceden hazırlanmış aselüler tabaka karışımını buz üzerinde collagen karışımıyla hazırlayın ve ardından altılı bir insert'in her birine bir mililitre saman sarısı çözeltiden ekleyin.

Kuyu tipi doku kültürü tepsisini, jelin katılaşması için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında jel katılaşırken, solüsyonun rengi sarıdan pembeye dönmelidir. Jel katılaşırken, kültür flaskındaki insan fibroblastlarını %0,25 tripsin EDTA ile beş dakika boyunca tripsinizleyin. Tripsinizasyon işlemini nötralize etmek için %10 FBS içeren DMEM ekleyin.

Ayrılmış hücreleri oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjle toplayın ve ardından hücreleri 1,5 mililitre %10FBS ile desteklenmiş DMEM içinde 4,5 x 10⁵ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Ardından, 50 mililitrelik bir tüpü önceden hazırlanmış hücresel tabaka kolajen karışımıyla doldurun ve tüpü buz üzerine yerleştirin.

Tüpe 1,5 mililitre fibroblast süspansiyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir aselüler tabaka kaplı inserte üç mililitre saman sarısı renkli hücresel tabaka çözeltisi ekleyin. Ardından, doku kültürü tepsisini inkübasyon süresi boyunca %5 karbon dioksit içeren bir doku kültürü inkübatöründe 37 derece Celsius'ta 45 dakika boyunca inkübe edin.

Hücresel tabaka solüsyonunun rengi de sarıdan pembeye dönmelidir. Üst tabaka jel katılaştıktan sonra, doku kültürü tepsisindeki insertin içine %10 FBS içeren iki mililitre DMEM ve dışına 10 mililitre ekleyin. Doku kültürü tepsilerini dört gün boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun dördüncü gününde jel büzülmesini kontrol ederek, her bir insertin içinden ve dışından medyumu aspire edin. Normal serumu yıkamak için insertlerin içine iki mililitre, dışına ise 10 mililitre yıkama medyumu ekleyin. Ardından, epidermis oluşumu için tepsileri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

İlk olarak insan keratinositleri tripsinize edinir. Ardından, ayrılan hücreler 200 G'de beş dakika santrifüj edildikten sonra tripsini nötralize etmek için beş dakika boyunca soya fasulyesi tripsin inhibitörü kullanın. Hücre peletini skin içinde mililitrede 4,17 x 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.

Keratinositler toplandıktan sonra birinci ortamı yeniden oluşturun. İnsan melanositlerini bir ila iki dakika boyunca tripsinle inkübe edin. Ardından, tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile nötralize edin.

Ardından, hücreleri daha öncekiyle aynı koşullar altında santrifüjle çöktürdükten sonra, melanosit peletini skin ortamında 8,3 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Medium 1'i de aynı şekilde hazırlayın. Sonrasında, hazırlanmış bir dermal tabaka doku kültürü tepsisindeki her bir insertin hem iç hem de dış kısmından yıkama medyumunu uzaklaştırın.

Her bir insertin içine 1,5 mililitre ve dışına 10 mililitre deri rekonstrüksiyon medyumu ekleyerek yıkama medyumunu değiştirin. Ardından, 600 mikrolitre keratinosit hücre süspansiyonunu 600 mikrolitre melanosit süspansiyonu ile karıştırın. Karıştırılmış hücre süspansiyonundan 200 mikrolitre dağıtın.

Her bir insertin içine damla damla ekleyin. Doku kültürü tepsisini 37 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. Hücreleri inkübe ettikten sonra, her bir insertin hem içinden hem de dışından skin, reconstruct medium one'ı aspire edin ve ardından insertlerin içine 2 mL skin, reconstruct medium two ve dışına 10 mL ekleyin.

Ardından, rekonstrüktleri 37 °C'de iki gün daha inkübe edin. İkinci iki günlük inkübasyonun ardından, her bir insertin içinden ve dışından deri rekonstrüksiyon medyumu iki'yi aspire edin. Şimdi, insertlerin yalnızca dış kısmına 7,5 mL deri rekonstrüksiyon medyumu üç ekleyin.

Rekonstrüktleri inkübatöre geri yerleştirin ve besiyerini değiştirin. 18. güne kadar gün aşırı olarak rekonstrükt besiyeri 3'ü ile değişim yapın. İnkübasyonun 18. gününde, deri rekonstrükt yüklü doku kültürü tepsisindeki insertlerin iç ve dış kısımlarındaki besiyerlerini aspire edin.

Ekleri pens ile tepsiden çıkarın. Polikarbonat filtreyi de kapsayacak şekilde, neşter ucuyla kenara yakın bir daire çizerek konstrüktü kesin. Ardından, filtre üzerindeki rekonstrüktü sert bir yüzeye yerleştirin ve bıçakla ikiye bölün.

Rekonstrüksiyonun bir yarısını siyah bir TBS biyopsi kağıdına yerleştirin ve ardından kağıdı bir histoloji kasetine koyun. Tüm kaseti dört saatten fazla süreyle %10 formalin içinde bekletin. Ardından kaseti %70 etanol içine yerleştirin ve rekonstrüksiyonu parafin gömme işlemi için hazırlayana kadar dört °C'de saklayın.

Rekonstrüksiyonun diğer yarısını, 4 °C'de bir ila iki saat boyunca %50 sükroz içerisinde bekletin. Ardından sükrozu 2 M ile değiştirin ve 4 °C'de bir ila iki saat daha saklayın. Bir taban kalıbının yarısını optimal kesme sıcaklığı (optimal cutting temperature), dondurma medyumu veya OCT ile doldurun.

Hava kabarcığı oluşumundan kaçının. Rekonstrüktün kenarından forsepsle tutun ve rekonstrüktü sakrozdan çıkarın. Sakroz emilene kadar Kim wipe üzerine yerleştirin.

Pens ve spatula kullanarak, rekonstrüktü OCT üzerindeki tekneye aktarın. Tekne tamamen dolana kadar rekonstrüktün üzerini daha fazla OCT ile kapatın. Yine, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

OCT'nin tamamen donmasını sağlamak için tekneyi kırılmış kuru buz üzerine eşit şekilde yerleştirin. Ardından baz kalıbını ve folyoyu sarın ve kriyostat ile kesmeye hazır olana kadar -70 °C'de saklayın. Bir farede deri rekonstrüksiyonu greftleme işlemine hazırlanmak için bir kabı sıvı azot ile doldurun ve 50 mL'lik bir tüpe 5 mL DMEM ekleyin.

Bir beherin içerisine 600 mililitre musluk suyu doldurun ve ısıtmak için beheri bir ısıtıcı plakanın üzerine yerleştirin. Ardından, yaklaşık altı haftalık dişi bir skid tüysüz outbred fare seçin. Fareyi izoflorin ile anestezi ettikten sonra.

İşlem boyunca anesteziyi sürdürmek için bir burun konisi kullanın. Hipotermiyi önlemek için steril oftalmik lubrikant uygulayın ve ısı desteği sağlayın. Ardından, fare derisini bileşik benzoik tinktür ve alkollü hazırlık tamponlarıyla temizleyin.

Sonraki sütür işlemi için aynı konumu korumak amacıyla fare sırtının üzerine bir çizgi işaretleyin. İris makası ve pens kullanarak fare sırtında yuvarlak bir yara yatağı kesin ve ardından yara yatağını steril gazlı bezlerle kapatın. Yuvarlak fare derisini 50 milliliter DMEM içeren tüpe yerleştirin.

Tüm besiyeri ve doku tamamen donana kadar tüpü bir sıvı azot kabına daldırın. Ardından, tüp tamamen çözülene kadar sıcak su dolu bir behere yerleştirerek çözdürün. Bu dondurma ve çözdürme işlemini üç kez tekrarlayın.

Bir deri rekonstrüksiyonunu bir insertten ayırmak için cerrahi bir bıçak kullanın. Membranı çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve ardından deri rekonstrüksiyonunu fare yara yatağının üzerine transfer edin. Şimdi, fare derisini deri rekonstrüksiyonunun üzerine yerleştirin.

İlk sütürün daha önce etiketlenmiş işaretçinin üzerinde ve ikincisinin ise altta olduğundan emin olun. Ardından, fare derisini sabitlemek için deri rekonstrüksiyonunun yan kısımlarında iki sütür daha kullanın. Greftleme işleminden sonra fare derisini temizleyin ve ardından fareyi yeni bir kafese yerleştirin.

18. günde, deri rekonstrüktünün epidermisi stratifiye keratinosit tabakalarından oluşur; farklılaşmamış bazal tabaka ve sırasıyla farklılaşmış tabakalar dikey olarak yönlenmiştir. Rekonstrükt kesitinin melanositik marker ile boyanması.

Siyah oklarla belirtilen S 100, melanositlerin epidermisin bazal tabakasında sıralandığını ve dendrit uzantıları aracılığıyla birden fazla keratinosit ile etkileşim kurduğunu göstermektedir. Dermal kompartman, bir kolajen tip bir matriksine gömülmüş fibroblastlar içerir; biriktirilmiş kolajen dört, epidermisi dermisten ayıran bazal membranı belirtir. Aşağıdaki şekiller, epidermisteki çok sayıda keratinosit tabakasının nasıl geliştiğini göstermektedir.

GFP lentiviral vektörü ile işaretlenmiş dermal kök hücreler fibroblastlarla birlikte gömüldüğünde, kolajen tip bir matris içerisinde epidermise göç ederler ve beşinci günde melanositlere farklılaşırlar. Keratinositlerin ekilmesinin ardından, tek hücreler kürelerden dışarı göç etmeye başlar.

Epidermisin hâlâ tek bir tabakadan oluştuğuna dikkat edin. Sekizinci günde, birkaç hücre epidermis-dermis ara yüzüne ulaşır.

10. güne gelindiğinde, burada görülebileceği üzere GFP pozitif hücreler bazal membran konumunda sıkı bir şekilde dizilmişlerdir. Epidermiste göç eden GFP pozitif hücreler, melanositik belirteç HMB 45 eksprese ederler. Melanoma hücre hatlarının farklı evreleri deri rekonstrüktlarına dahil edildiğinde, hücrelerin davranışı in vivo özelliklerini yansıtır.

Burada, 2D kültürlerde büyütülmüş normal melanositler ve melanoma hücreleri bu şekilde görülebilir. Burada görüldüğü üzere, cilt rekonstrüksiyonlarında normal melanositlerin konumu ve büyüme hızı sıkı bir şekilde kontrol edilir; radyal büyüme evresindeki primer melanomalar ağırlıklı olarak epidermiste çoğalırken, dikey büyüme evresindeki melanomalar bu şekilde görüldüğü gibi dermise doğru invaziv olarak büyür. Son olarak, metastatik melanomaların dermisin derinliklerine agresif bir şekilde nasıl invaze olduğu burada görülebilir.

Normal cilt üzerindeki çalışmalarımız, melanom gelişimi ve ilerlemesinin daha iyi anlaşılması için temel oluşturmaktadır.