Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Bu deneyin amacı, korteksteki kritik durum dinamiklerinin karakteristik özelliği olan sağlıklı beyin aktivitesinin nöronal avalanslar şeklinde kendi kendini organize etmesini incelemektir. Bu, koronal katmanlı korteks kesitinin, kortekse gelişimsel olarak önemli dopaminerjik girdiler sağlayan bir orta beyin kesitiyle birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, korteks-orta beyin ko-kültürü, kültürdeki nöronal aktivitelerin çok noktalı stimülasyonuna ve kaydedilmesine olanak tanıyan bir çoklu elektrot dizisi (multi electrode array) üzerinde büyütülür.

Ardından, ko-kültürün ilk bir ila iki hafta boyunca, kültürü normal hava ve besiyeri maruziyetine tabi eden döngülerle çalışan özel tasarım bir inkübatörde düzleşmesine, yayılmasına ve MEA yüzeyine tutunmasına izin verilir. Uzaysal-zamansal yerel alan potansiyeli patlamalarının kendiliğinden nöronal avalanşlara dönüştüğünü gösteren sıvı sonuçlar elde edilir. Bu sonuçlar, MEA kayıtlarına ve avalanş boyutlarındaki güç yasasını tanımlayan çevrimdışı avalanş analizine dayanmaktadır.

Bu tekniğin, disosiye kültürler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sistemler nörobilimi boyutudur. Birçok beyin bölgesini birlikte kültürleyebiliriz ve bu çok bölgeli kültürler, kortikal katmanlar ve projeksiyon sistemleri gibi geniş ölçeklerde doğru bir beyin organizasyonu oluşturur. Bu tekniğin uygulamaları, yalnızca nöronal avlanmaların incelenmesinin ötesine geçer.

Örneğin, kesin şekilde kontrol edilen in vitro koşullar altında, ağ düzeyindeki uyarana verilen yanıtı inceleyebiliriz. Plazma trombin karışımının uygun şekilde uygulanması ve dokunun MEA üzerine yerleştirilmesi öğrenmesi zor işlemler olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu adımlar; uygun zamanlama, doğru sıcaklık gradyanı ve hassas MEA yüzeyine doğrudan temas etmekten kaçınılmasını gerektirir.

Kayıtlar için steril ve sızdırmaz bir cam hazne hazırlamak için, önce Teflon plastik kapaklı dişli cam silindirleri, dişin altından yaklaşık iki milimetre mesafeden kesin. Bunlar, kültür haznesinin güvenli ve sıkı bir şekilde kapatılması için gereklidir. Ardından cam halkaları üç kez suyla durulayarak temizleyin ve sonrasında 200 proof etil alkol içerisinde beş dakika kaynatın.

Bunları kuruması için kenara ayırın; cam halkaları MEA yüzeyine yapıştırmak için bir silikon çözeltisi gereklidir. Bir cell guard 180 4 silikon elastomer kiti kullanın ve A ile B parçalarının 15 mililitresini iyice karıştırın. Ardından, hava kabarcıklarının çıkması için 15 dakika bekletin.

Çözeltiyi bir mililitre Eloqua olacak şekilde ayırın ve gelecekteki kullanımlar için -20 °C'de saklayın. Şimdi, küçük gauge bir iğneye sahip şırınga ile 23 °C'de bir mililitre silikon alıp bunu cam halkanın cilalanmamış kesik yüzeyine uygulayarak cam halkayı MEA'ya yapıştırın. Ardından cam halkayı MEA üzerinde ortalayın ve daha güçlü bir sızdırmazlık için halkanın dış çevresine ek bir silikon tabakası uygulayın.

Bunu bir ısıtıcı plaka üzerinde yaklaşık 60 °C'de bir ila iki saat boyunca kürlenmeye bırakın. Ardından, MEA haznesini ve hazne kapaklarını, önce üç kez deiyonize suyla, ardından son durulama için üç kez %70 alkolle yıkayarak laminar akışlı kabin altında sterilize edin. Hazneyi alkol içinde 10 dakika boyunca bekletin.

Ardından, hazne ve kap iç yüzeyini 10 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. 120 °C'de 45 dakika boyunca otoklavlayın. Sterilize olduktan sonra kurumaya bırakın.

Şimdi kültür odası içindeki MEA yüzeyini poly D lysine ile kaplayın. Bu deneyde kullanılan yeni MEA'lar oldukça lipofilik olduğundan, kaplama işlemini tekrarlayan damlacıklar halinde gerçekleştirin. Çözeltiyi elektrot ızgarasından aspire edin.

Saklama ve gelecekteki kullanım için MEA haznesini mühürlemek üzere kapağı takın. Bu prosedür, yaklaşık 12 ko-kültür için korteks ve VTA kesitleri sağlar ve sağlıklı, doğum sonrası bir ila iki günlük hayvanlar kullanılarak steril koşullar altında, laminer akışlı kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir; doku toplama işlemi için toplam süre bir saatten kısa olmalıdır. Dekapitasyon sonrası, önce kafa derisindeki deriyi çıkarmak için iki yan makas kesiği yaparak beyin çıkarma işlemine başlayın.

Kafatası önce çıkarılır ve ardından ince göz makasları kullanılarak, korteks-serebellum birleşim noktasında bir sagittal orta hat kesisi ve bir koronal kesi yapılarak açılır. Beyni açığa çıkarmak için bu dört kafatası flebinin tamamı geriye doğru çevrilir. Ardından, sivriltilmiş bir spatula ile olfaktör bulb üzerinden frontal olarak kesi yapılır.

Ardından spatulayı beynin altına dört bir yandan yerleştirin. Beyni nazikçe kafatasından kaldırın ve hızlı soğutma ile geçici saklama için soğutulmuş gaz çözeltisinin içine kaydırın.

Yukarıdaki prosedürü iki beyin daha için tekrarlayın. VTA dokusunu elde etmek için beyinleri steril, kuru bir Petri kabına aktarın. Küçük bir spatula kullanarak, her bir beyni nazikçe yaklaşık bir santimetre yana kaydırarak fazla sıvıyı uzaklaştırın.

Ardından, beyin sapını çıkarmak için serebellum seviyesinden koronal dikey bir kesi yapmak üzere bir jilet kullanın. Şimdi, dilimleme prosedürü sırasında beyinlerin mekanik stabilizasyonu için bir agar bloğunu bir montaj diskine yapıştırın. Daha sonra, disk üzerindeki agar bloğunun birkaç milimetre önüne ince bir hat şeklinde hızlı yapıştırıcı sürün, ancak küçük bir spatula kullanarak yapıştırıcının agara temas etmediğinden emin olun.

Her bir beyni frontal polleri aşağı gelecek şekilde transfer edin ve sabitleyin. Frontal pollerin sabitleme diskine yapıştırıldığından ve ventral tarafların herhangi bir yapıştırıcı kalıntısı olmadan agara temas ettiğinden emin olun. Bu işlem, kesme sırasında uygun mekanik stabilizasyon ve kesilen dilimlerin kolayca kaldırılmasını sağlar.

Ardından, monte edilmiş beyinlerin bulunduğu montaj diskini, soğutulmuş gaze çözeltisi ile doldurulmuş bir vibratom tepsisine dikkatlice daldırın ve sabitleyin. Daha sonra, dikkatlice temizlenmiş bir jiletle, orta beynin 400 µm kalınlığında koronal kesitlerini, en yüksek vibrasyon frekansında ve nispeten düşük ilerleme hızında kesin; vakumlu pompa uçlu ters bir pasta pipeti kullanarak VTA içeren dilimleri toplayın ve kortikal kesitler için steril soğutulmuş gaze çözeltisi ile doldurulmuş 35 x 10 mm Petri kaplarına aktarın. Önceki dilimleme adımlarını tekrarlayın, ancak korteks ile serebellum arasında dikey bir kesi yapın ve dört beyni frontal pol yukarı gelecek şekilde monte edin.

Striatum seviyesinden başlayarak yaklaşık 350 mikrometre kalınlığında üç koronal kesit toplayın. Şimdi, kırık jiletlerden yapılmış bir mikro bıçak kullanarak, bir stereo mikroskop altında frontal korteks ve VTA'yı içeren orta beyin bölgelerinden yaklaşık iki milimetre genişliğinde koronal kesitler çıkarın. Doku kesitlerini, soğutulmuş gaze solüsyonu ile doldurulmuş küçük kaplara ayrı ayrı toplayın.

Dokuyu MEA haznesinin birinci konumuna yerleştirmeye başlamak için, önce oda sıcaklığındaki MEA'yı, elektrot dizisi netleşmiş olacak şekilde bir stereo mikroskop altında konumlandırın. Ardından, temiz, tozsuz ve steril elektrot dizisi matrisinin merkezine 25 µL plazma damlası damlatın. Küçük bir spatula kullanarak bir korteks ve VTA kesitini dikkatlice plazma damlasının içine kaydırın.

Şimdi MEA'yı bir soğutma plakasına yerleştirin ve görüntüyü yeniden odaklayın. Plazma damlacığına 25 microliter trombin eklemeden önce yaklaşık 15 saniye boyunca soğumasını bekleyin. Ardından, trombin pipet ucuyla plazma-trombin karışımını MEA üzerine küçük dairesel hareketlerle dikkatlice yayın.

Kırılgan elektrot dizisine doğrudan dokunmamaya dikkat edin. Ardından, korteksi, dorsal kenarı dizinin ikinci elektrot sırası boyunca hizalanacak şekilde dizinin üzerine nazikçe yerleştirin. Bu sayede, gelişmekte olan yüzeysel katmanlar zamanla dizinin geri kalanını kaplayacaktır.

Ardından, VTA'yı korteks kesitinin ventral sınırına bitişik şekilde yerleştirin. Şimdi, yüksek nemi korumak için MEA haznesinin kapağını kapatın ve gevşekçe sıkın. Plazma trombini koagülasyonunun gerçekleşmesi için MEA kültür düzeneğinin oda sıcaklığında, çeker ocak içinde yaklaşık altı dakika boyunca beklemesine izin verin.

Bu sırada, üç kültür daha hazırlamak için prosedürü tekrarlayın. Ardından, 25 gauge 5/8 boyutunda bir iğneye sahip 1 cc'lik bir şırınga kullanarak, kültür odacıklarına dikkatlice küçük damlalar halinde 600 µL kültür ortamı ekleyin. Daha sonra MEA odacığını sıkıca kapatın ve MEA kültür düzeneğini inkübatör içindeki sallanan saklama tepsisine yerleştirin.

İki gün sonra, in vitro ortamda, 10 µL mitoz inhibitörü ekleyin. Ardından, in vitro sürecin dördüncü gününde ve sonrasında her dört günde bir, kültür medyasının %60'ını yenileyin. Normal büyüme sırasında, kültür önemli ölçüde düzleşecek ve dorsal yönde hafifçe genişleyecektir.

Yüzeyel kortikal katmanların gelişimi nedeniyle, sağlıklı bir kültür parlak alan mikroskobunda opak grimsi dokusuyla tanımlanır. Buna karşın, kültürlerin hazırlanmasından yaklaşık 10 ila 12 gün sonra ortaya çıkan ve ölü dejeneratif hücrelerin karakteristik özelliği olan parlak yansıtıcı veziküller oluştuğunda, kayıt ve stimülasyon için hazır hale gelirler. Bir kayıt oturumuna başlamak için MEA, saklama tepsisinden kayıt kafa aşamasına aktarılır.

Yerel alan potansiyelini veya LFP'yi kaydetmek için 1 ila 200 hertz değerinde bir bant geçiren filtre kullanın. Çoklu ünite aktivitesi, 300 ila 3000 hertz değerindeki bir bant geçiren filtre kullanılarak da incelenebilir. Sağlıklı spontan aktivite, genellikle farklı boyut ve sürelerdeki patlamalar şeklinde gerçekleşme eğilimindedir.

LFP ile ünite aktivitesi arasındaki ilişkiyi incelemek için, LFP'nin spike tetiklemeli ortalamaları hesaplanabilir. Bu korteks kültürleri için, negatif LFP sapmaları, stimülüsle tetiklenen aktiviteyi kaydetmek amacıyla nöronal spike'lar ile korele edilmiştir. İlk olarak, stimülasyonların zamansal dalga formu ve genliği, bir stimülasyon jeneratörünü kontrol eden yazılımla belirlenir.

Yararlı bir stimülasyon paradigması, bipolar kare dalga formuna sahip, akım kontrollü, yük nötr tek şoktur. Ardından, stimülasyonların uygulanması için kullanılacak bir elektrot seçilir. Tipik stimülasyon kaynaklı LFP yanıtları, spontan aktivite patlamalarına benzer görünür.

Blanking devreleri, stimülasyon artefaktlarını azaltmak ve amplifikatör doygunluğunu önlemek için stimülasyon sırasında amplifikatörlerin bağlantısını keser. Stimülasyon elektrodunun stimülasyondan sonra toparlanması için birkaç saniye gerekir ve bu nedenle yanıt aktivitesini kaydetmek için kullanılamaz. MEA üzerinde, genellikle diğer bölgelerdeki aktivite ile birlikte, tek bir elektrottaki aktivite ile karakterize spatiotemporal kümeler ortaya çıkma eğilimindedir.

Aynı zamanda, bu tür aktivite dönemleri sırasındaki tipik LFP dalga formları, her küme için birkaç saniye arayla meydana gelen üç kümenin üst üste çizilmesiyle burada gösterilmiştir. Birden fazla negatif sd eşiğini aşan NLFP pikleri çıkarıldığında, bir saniyelik pencere içinde birkaç elektrotte negatif LFP sapmaları görülebilir; NLFP pik zamanları şeklindeki aktivite, nokta sütunlarının çeşitli elektrotlardaki neredeyse eşzamanlı NPS'leri temsil ettiği bir Rasta üzerinde kolayca görselleştirilebilir. Bu aktivitenin spasyotemporal organizasyonu oldukça karmaşıktır.

Düşük zamansal çözünürlükte aşağı yukarı homojen görünen sütunlar, daha yüksek zamansal çözünürlükte ayrı kümelerden oluşur ve bu durum böylece devam eder. Uzay, GEOTEMPORAL ve LFP kümelerinin ortaya çıkışı, kortikal ağlarda oldukça düzenlidir. Daha spesifik olarak, bu organizasyon nöronal avalanşlar için ölçekten bağımsızdır.

Bu durum, belirli bir zamansal çözünürlükte (Delta T) küme boyutlarının olasılığının hesaplanmasıyla gösterilir. Burada kümeler, aynı veya ardışık zaman aralıklarında meydana gelen NL FPS'lerden oluşur; böyle bir kümenin boyutu, küme başına toplam NFP sayısı veya küme başına entegre NLFP genlikleri cinsinden ifade edildiğinde, küme boyutu dağılımları eksi 1,5'e yakın bir üste sahip bir güç yasası ortaya koyar. Bu videoyu izledikten sonra, nöronal aktivitenin öz-organizasyonunu incelemek amacıyla beyin dokusunun nasıl dikkatle diseke edileceği ve çok elektrotlu diziler üzerinde kültürlerin nasıl büyütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yöntemler, kortikal ağlarda spontan aktivite ile uyarılmış aktivite arasındaki ilişkiyi incelemek için de kullanılmıştır.