Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar'da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik merkezi sinir sistemindeki nöronlarda gen ekspresyonunu değiştirmektir. Bu işlem, öncelikle zamanlanmış gebe dişilerin elde edilmesi ve cerrahiye hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, abdominal bir insizyon yapılarak uterus kornuları açığa çıkarılır.

Embriyolar açığa çıkarıldığında, DNA lateral ventriküle, üçüncü ventriküle veya subretinal boşluğa enjekte edilir. Prosedürün son adımı, rahim duvarı üzerinden embriyoya elektrik akımı uygulamaktır; bu sırada palet elektrotlar, pozitif kutup tercih edilen transfeksiyon bölgesinin üzerine gelecek şekilde yönlendirilir. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla nöroprogenitörlerin tline kelon dying kelon ve retinadaki proliferasyonunu, migrasyonunu ve diferansiyasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, transgenik farelerin dejenerasyonu gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı; hızlı olması, daha yüksek kapasiteli çalışmalara olanak tanıması ve daha düşük maliyetli olmasıdır. Bu yöntem; hangi genlerin nöral progenitörleri, hücre proliferasyonunu, hücre kader belirlemesini, nöronal diferansiyasyonu ve hücre migrasyonunu düzenlediği gibi nöral gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, birçoğu insanlarda kognitif bozulma ve davranışsal bozukluklarla sonuçlanan merkezi sinir sistemi (CNS) gelişimindeki kusurların temelinde yatan genetik yolların daha iyi anlaşılmasına kadar uzanabilir ve merkezi sinir sistemi gelişimini anlamadaki faydasının ötesine geçebilir.

Bu teknik; gelişmekte olan periferal sinir sistemi, kalp ve plasenta gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Ayrıca farelerdeki hastalık modellerinin yanı sıra civciv ve xip gibi diğer model organizmaların incelenmesinde de kullanılabilir. Genellikle, bu tekniği yeni deneyimleyen kişiler için başarının önündeki temel engel embriyo sağkalımıdır; embriyolarla manipülasyon yapılırken, enjeksiyon uygulanırken ve boşaltma işlemi gerçekleştirilirken dikkatli olunmalıdır.

Bu yönteme dair ilk fikrimiz, embriyonik telensefalon ve retinada gen ekspresyonunu manipüle etmek için hızlı bir araca ihtiyaç duyduğumuzda ortaya çıktı. Bu tekniği, Sal tarafından 2001 yılında Developmental Biology dergisinde yayınlanan ve başlangıçta tanımlanan yöntemi modifiye ederek laboratuvarımızda geliştirdik. Ayrıca, bu protokolü gelişmekte olan dilon üzerinde de kurmak için bir crash laboratuvarı ile birlikte çalıştık.

Enjeksiyon ve elektroporasyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü bu adımlar embriyoların çok dikkatli bir şekilde manipüle edilmesini gerektirir ve enjeksiyon bölgeleri bazen çok küçük olabilir. Örneğin, subretinal boşluk. Prosedürü bugün, Sherman Laboratuvarı'ndan doktora sonrası araştırmacı Rajivle göstereceğiz. Başlamak için tüm cerrahi aletleri temizleyin ve sterilize edin. Ardından, şırıngaları salin solüsyonu ve laktatlı ringer solüsyonu ile doldurun ve cerrahi alanda ısıtılmaları için bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.

Bir ısıtma pedini %70 etanol ile sterilize edin ve ardından üzerine sterilize edilmiş, tüy bırakmayan bir gazlı bez yerleştirin. Isıtma pedini 37 °C'ye ayarlayın. Hayvanı küçük bir anestezi kabinine yerleştirin ve bir vaporizatör aracılığıyla dakikada 1 L oksijen ile %5 izofluran vererek anestezi uygulayın.

İzofloran egzozunun bir geri kazanım sistemi kullanılarak toplandığından emin olun. Hayvanın solunumu derin ve düzenli hale geldiğinde, onu hazneden çıkarın. Parmak sıkıştırma ve göz kırpma reflekslerini kontrol edin.

Tam anesteziyi sağlamak için; anestezi altındaki hayvanı karnının üzerine yerleştirin ve cerrahi işlem sırasında %2,25 izofluran iletmek için bir respiratör tüpü kullanın. Ense bölgesinden deri altına, vücut ağırlığının kilogramı başına 0,1 mg konsantrasyonda buprenorfin enjekte edin.

Hayvanın solunumunu izlemeye devam edin ve gerekirse izoflorin akışını ayarlayın. Ardından, anestezi altındaki hayvanın göğüs kısmını bantlayın ve küt uçlu pensle arka ayağı sıkarak retraksiyon yanıtını tekrar kontrol edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, alt tüylerin tamamen kaplandığından emin olacak şekilde karın bölgesine kalın bir tabaka krem sürün.

Kremi yaklaşık üç dakika boyunca bekletin ve kılların dökülüp dökülmediğini ara ara kontrol edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, steril bir gazlı bezi steril su ile ıslatın ve karın bölgesindeki kılları silerek temizleyin. Ardından, insizyon bölgesini klorheksidin ve ek su ile sterilize edin.

Karın bölgesini temiz steril gazlı bezle kurulayın. Bu adımı, sterilize edilmiş taze pamuklu gazlı bez kullanarak %70 etanol ile tekrarlayın. Uterus boynuzlarını açığa çıkarmak için cerrahi giysileri giyerek ameliyata hazırlanın.

İlk olarak, orta hattaki deri altındaki silik çizgi olan linea alba'yı belirleyin. Pens yardımıyla deriyi abdominal duvardan ayırın ve kavisli pens ile makas kullanarak, karın orta kısmından aşağıya doğru deri makasıyla küçük, düz bir insizyon yapın. Aynı işlemi periton için de tekrarlayın. Peritonu pens ile kavrayın.

Geri çekin ve ardından uterusu çekebilecek büyüklükte bir insizyon yapın. İnsizyonun üzerine küçük bir dikey yarığı olan steril gazlı bez yerleştirin ve bunu sıcak steril salin ile nemlendirin. Ardından, forsepsleri insizyonun içine sürün ve forsepslerle insizyonu açık tutarak uterusu bulun.

Birinci ve ikinci görünür embriyolar arasından uterusu kavrayın ve uterus kornularının her iki yanını gazlı bez üzerine çekin. Herhangi bir rezorpsiyonu veya vücut boyutu küçük olan embriyoları kaydederek embriyo sayısını belirleyin. Doğru sayıda DNA enjeksiyonu hazırlamak için uterus kornularını salin ile ıslatın ve bir uterus kornusunu dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin.

Cerrahi iğneleri doldurmak için, metil yeşili boya içeren 3 mg/mL endotoksin içermeyen DNA solüsyonundan 10 µL çekmek üzere ağızlığı takılı bir pastur pipeti kullanın ve DNA'yı cerrahi iğneye aktarın. Doldurulan ilk iğneyi mikromanipülatöre monte edin.

Enjektöre, ovaryuma en yakın olan embriyodan başlayarak yerleştirin. Embriyoyu decidua içinde, enjeksiyonların ROS roll'dan kordal yöne doğru gerçekleşmesini sağlayacak şekilde yüzü öne bakacak şekilde nazikçe döndürmek için dairesel forsepsler kullanın. Embriyonik beynin orta hattını belirlemek için bir fiber optik ışık kaynağı kullanın.

Rostral bölgelerdeki yan yana konumlanmış geniş lateral ventrikülleri fark edin. Embriyoyu kavisli pens yardımıyla sabit tutun ve içi doldurulmuş cerrahi iğneyi, beyne giriş açısı yaklaşık 45 derece olacak şekilde uterusun üzerine konumlandırın. Hızlı ve kararlı bir hareketle, mikro manipülatör üzerindeki düğmeyi çevirerek iğne ucunu uterus duvarından geçirin ve embriyonik beynin lateral ventrikülüne yerleştirin.

Ardından, mikro enjektörün ayak pedalına basın. DNA solüsyonunu enjekte etmek için yapılan işlemin başarısı, metil yeşili boyasının embriyonik beyin ventrikülleri boyunca yayılmasının kolayca gözlemlenmesiyle anlaşılır. DNA enjekte edildikten sonra, herhangi bir kırılmaya neden olmadan iğneyi çıkarmak için yavaşça geri çekin.

Enjekte edilen embriyoyu steril gazlı bezin üzerine yerleştirin ve ılık salin ile iyice ıslatın. Uterusu, transfeksiyonun istenen bölgesinin üzerine yerleştirilmiş kürek elektrotun pozitif kutbu ile kavrayın. Ardından, saniyede bir impuls hızında, 40 ila 50 volt ve 50 milisaniye değerlerinde beş kare elektrik impulsu uygulayın.

Enjekte edilmiş ve elektropore edilmiş embriyoyu koruyucu ıslak gazla örtün ve ardından bir sonraki embriyoyu enjekte etmeye geçin. Uterin kornudaki istenen tüm embriyoların enjeksiyonu ve elektroporasyonu tamamlandığında, kornuyu dikkatlice vücut boşluğuna geri itin. Kalan embriyoların enjeksiyonuna ve elektroporasyonuna başlamak için ikinci uterin kornuyu çıkarın.

Tüm embriyolar uterusun içine geri yerleştirildiğinde, abdominal kaviteye iki ila üç mililitre sıcak salin ekleyin ve ardından peritonun yanlarını ortaya çıkarmak için gazlı bezi abdomenden çıkarın. Peritonu dikmek için siyah örgü ipek hattı kullanın; hattı sternuma en yakın periton noktasına sabitleyin ve sabitleme noktasından uzaklaşarak dikişe devam edin. Tüm dikişlerin sıkı olduğundan ve alttaki organların veya derinin peritona dikilmediğinden emin olun.

Kalan sütür hattını kesin ve atın. Cilt kapama zımbalarını kullanarak, forseps ile cildi sütür hattının üzerinde kapatacak şekilde çekin. Alttaki sütür hattını zımbalamaya veya cildi çok sıkı çekmemeye dikkat ederek cildi zımbalayın.

İşlem tamamlandığında, zımbaların sıkı olduğundan emin olmak için bunları buradaki sütür aletiyle nazikçe birbirine bastırın. GFP ekspresyonunu yönlendiren A-P-C-I-G iki ekspresyon vektörü, E 12 aşamasındaki gelişmekte olan neokortekse elektropore edilmiştir. Neokortikal gelişim ilerledikçe, apikal progenitörler ya sekonder bazal progenitörlere ya da post-mitotik nöronlara farklılaşır ve GFP eksprese etmeye devam ederler. Bu nöral hücreler daha sonra, kırmızıyla gösterilen nöral alt tipin tipik markerlarının ekspresyonu açısından analiz edilebilir.

E 12'de elektropore edilmiş ve E 14'te diseke edilmiş bir embriyonun ön beyninin bu ventral görünümünde, elektropore edilen bölge E 14'teki yeşil epi-floresan ile belirtilmiştir. GFP ekspresyonu talamus, pre-talamus ve hipotalamusta görülmekte olup bu durum, hedef bölgelerin başarıyla transfekte edildiğini göstermektedir. Kesikli kutu, ventriküler zon boyunca alınan kesitin konumunu işaretlemektedir.

Ventriküler bölgeye daha yakından bakıldığında, GFP hücrelerinin ventriküler bölgeden ayrılarak manto bölgeye göç ettiği görülür. Hipotalamik çekirdeklerin oluşacağı yerin yanı sıra, E 15.5'te PCIC ile elektropore edilmiş E 16.5'lik bir embriyodan alınan bu koronal kesitte gösterildiği gibi embriyonik retina da kolayca elektropore edilir. Burada, m cherry pozitif hücrelerin birikimi dış nöroblast tabakasına özgüdür ve ganglion hücre tabakasındaki Brn3b pozitif retinal ganglion hücrelerinde görülmez. Bu teknik uzmanlaşıldığında, beklenmedik bir komplikasyon ortaya çıkmadığı sürece 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, uygun steril tekniklerin kullanılması, embriyolarla çalışırken ellerin titretilmemesi ve gebe dişiye anestezik uygulanmadan önce gerekli tüm malzemelerin hazır bulundurulması önemlidir. Bu prosedürün ardından, elektro-braid yöntemiyle manipüle edilmiş embriyolar yetişkinliğe kadar yaşayabilir; bu aşamada, embriyodaki belirli genlerin manipülasyonunun yetişkinlerdeki nöronal fonksiyonları nasıl etkilediğine dair ek soruları yanıtlamak için davranışsal ve fonksiyonel analizler gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildiği tarihten itibaren bu teknik, MSS gelişimi alanındaki araştırmacıların farelerde in vivo olarak gen fonksiyonlarını incelemelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik nöral tüpe yabancı DNA'nın nasıl aktarılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız. Özellikle, gebe bir dişinin cerrahiye nasıl hazırlanacağını, uterusun nasıl açığa çıkarılacağını, DNA'nın nasıl enjekte edileceğini ve embriyonun nasıl elektrolize edileceğini gösteriyoruz.

İzoflorin ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken bir tahliye sistemi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.