Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Bu prosedürün genel amacı, kronolojik yaşam süresini bir dizi basit DNA hasarı ve mutasyon analizi ile birleştirerek mayadaki yaşa bağlı genomik instabiliteyi incelemektir. Bu işlem, öncelikle kronolojik yaşlanma kültürlerinden her iki günde bir örnekleme yapılarak ve koloni oluşturan birim veya CFU oluşumu yoluyla canlılık kontrol edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, yaşlanan kültürlerden örnekleme yapılması ve hücrelerin mutasyona özgü seçici besiyerine ekilmesiyle DNA mutasyonlarının incelenmesidir.

Nihayetinde, mutasyon analizi sonuçlarının canlılık oranına göre normalize edilmesi yoluyla, mayaların kronolojik yaşlanması sırasında DNA mutasyonlarındaki değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, yaşlanma alanındaki temel soruların, örneğin yaşlanma ve genomik instabiliteyi birbirine bağlayan mekanizmaların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mayaların kronolojik yaşam süresini veya CLS'yi analiz etmek için, öncelikle tek bir maya kolonisini bir mililitre sentetik komplet glukoz veya SDC ortamına inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu kültürü taze SDC ortamının 10 mililitresi içinde OD 600 değeri 0,05 ile 0,1 olacak şekilde dilüe edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak üç gün boyunca inkübe edin.

Hücrelerin stasyoner fazda olduğu üçüncü günde, her Eloqua örneğini otoklavlanmış su ile 10.000 kat seyreltin, ardından flasktan iki adet 10 µL'lik alikot alın ve her bir seyreltilmiş kültürden 10 µL'yi A-Y-E-P-D plaklarına ekleyin. Koloniler oluşana kadar plakları 30 °C'de inkübe edin. Üçüncü gün kültüründen ortaya çıkan koloni sayısı veya koloni oluşturan birimler %100 sağkalım olarak kabul edilir.

Plakaya ekim yapmak için sonraki günlerde yaşlanan kültürden alikotlar almaya devam edin. CFU analizinde yaklaşık 20 ila 100 koloni oluşmasını sağlamak için dilüsyon faktörlerini buna göre ayarlayın. Örnekleme, kültürün canlılığı %1'in altına düştüğünde durdurulur; bu durum genellikle 11. ve 13. günler arasındadır; hücre canlılığı ayrıca plaklarda yaşlandırılan hücrelerde de incelenebilir.

Bu analize başlamak için tek bir koloniyi bir mililitre sentetik komple glukoz besiyerine inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Kültür mililitre başına yaklaşık 10⁸ hücreye ulaştığında, kültürü otoklavlanmış su ile 10 µL başına 100 ila 200 hücre ve 10 µL başına 1000 hücre olacak şekilde dilüe edin. Her suş için, ekim yoğunluğuna göre etiketlenmiş sekiz ila 20 adet triptofan eksik SDC plakasından oluşan bir set hazırlayın.

Yaşlanma sırasında azalabilecek canlılık ihtimalini göz önünde bulundurarak, 10 ila 100 koloninin sayılabildiğinden emin olmak için, her plakka 10 ila 30 µL seyreltilmiş kültürden oluşan iki alikot ekleyin. Plak setini 30 °C'de inkübe edin; ekim gününde ve ardından her iki günde bir, bir plak çıkarın ve canlı hücrelerin büyümesini sağlamak için damla damla 0,5 mL triptofan ekleyin. Plağı 30 °C'de ek bir 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin.

48 ila 72 saat sonra. Kronolojik yaşlanma sırasında DNA hasarını ve mutasyon sıklığını değerlendirmek için, triptofan ekleme günündeki canlılığı belirlemek amacıyla CFU sayımı yapın. Maya CLS analizi için, özel özelliklere sahip bir dizi suş, vahşi tip suş ile paralel olarak büyütülür.

Spontan mutasyon frekansı, kronolojik olarak yaşlanan bir kültürde canavanin direnci frekansı ölçülerek değerlendirilebilir. Plazma arginin permeazını kodlayan can1 genindeki mutasyonlar, hücreleri arginin analoğu L-canavanin'e karşı dirençli hale getirir. Canavanin dirençli hücreler, L-canavanin sülfat ile desteklenmiş, arginin eksik sentetik kompleks besiyeri plaklarında büyüyecektir. trip1 kodlama dizisinde amber mutasyonu içeren bir suşta trip pozitif reversiyon frekansının ölçülmesi, maya kronolojik yaşlanması sırasında baz substitüsyon hızının tahmin edilmesine olanak tanır.

Pozitif reversiyon hücreleri, triptofan eksikliği olan plakalarda büyüyecektir. Liz negatif suş EH150, açık okuma çerçevesinde artı dört kaymaya sahiptir; bu durum lizin için oks atrofiye yol açar ve küçük insersiyon veya delesyon mutasyonlarıyla geri döndürülebilir. Kaba kromozomal yeniden düzenlemeleri veya gcr'yi tespit etmek için revertantlar, lizin eksikliği olan plakalarda seçilecektir.

HX T 13'ün kromozom beşte can one'ın telomerik tarafında 7,5 kilobaz uzağında yer aldığı ve U üç kasetiyle bozulduğu bir mutant suş kullanılır; can one ve U üç genlerinin her ikisindeki mutasyonlar hücreleri sırasıyla L Canavan ve beş florootik aside karşı dirençli hale getirir. Her iki gende meydana gelen nokta mutasyonlarının sıklığı düşük olduğundan, hem El Canavan hem de beş florootik aside karşı direnç sıklığının analizi, homolog ve homolog olmayan rekombinasyon seviyesini izlemek için gcr tahminini sağlar. Kronolojik yaşlanma sırasında, ya %100 homolog ters tekrarlar ya da %91 homolog tekrarlar taşıyan mutantlar oluşturulur.

IRS'deki his üç lokusu arasındaki rekombinasyon, fonksiyonel his üç proteininin ekspresyonuna olanak tanır. Bu nedenle, rekombinasyonun gerçekleştiği hücreler, galaktoz ile desteklenmiş histidin eksikliğindeki plakalarda büyüyecektir. Hücrelerin stasyoner faza girdiği üçüncü günde, her bir yaşlanma kültüründen uygun miktarda hücre alınacaktır.

Tüm analizler için aynı prosedür uygulandığından, yalnızca tek bir örnek işlenecektir. Bu videonun amacı doğrultusunda, hücreleri bir masaüstü santrifüjle döndürerek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre otoklavlanmış su içerisinde yeniden süspande edin.

Süpernatantı tekrar uzaklaştırın ve hücre peletini 100 µL su içinde yeniden süspanse edin; istenen revertantları seçmek için hücreleri uygun plakalara ekimleyin. Plakaları 30 °C'de inkübe edin ve üç ila dört gün sonra CFU'ları sayın; mutasyon frekansı canlı hücre sayısına göre normalize edilir. Bu grafik, yabani tip hücrelerin kronolojik sağkalımı ile S CH nine delta TOR one delta ve RAs two delta mutantlarının sağkalımı karşılaştırıldığında, tipik bir kronolojik yaşam süresi analizinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir.

Sıvı kültürde TOR1, SCH9 veya RAS2 eksikliği olan mutantlar uzamış bir kronolojik yaşam süresi sergiler. Ayrıca, SCH9 ve RAS2 eksiklikleri, çeşitli karbon kaynaklarının varlığında kronolojik sağkalımı artırarak uzun ömürlülük üzerinde ekleyici bir etki gösterir. NC2 canlılık testi kullanımı bir sonraki grafikte gösterilmiştir.

Birinci gün, SDC vahşi tip kültürleri seyreltildi ve karbon kaynağı içermeyen SC trip dropout plakalara ekildi. Glikoz, etanol veya gliserol ile desteklenmiş SC Tripp dropout plakaları 30 °C'de iki günde bir inkübe edildi. Her setten bir plaka alındı ve büyüme ile koloni oluşumunu sağlamak için uygun besinler eklendi.

Yaşa bağlı mutasyon frekansı; suşa, arka plana, genetik manipülasyona, kültüre, koşullara ve yaşa bağlı olarak büyük ölçüde değişiklik gösterir. Bu tablo, bir vahşi tip suşta elde edilen tipik sonuçları göstermektedir. Lezyon ötesi sentezin temsili sonuçları bir sonraki görüntüde gösterilmiştir.

Yaşa bağlı mutasyon frekansı artışı, nükleer ekstraktlar ve çeşitli DNA şablonları kullanılarak yapılan hatalı DNA onarımındaki değişiklikleri içerebilir olabilir. Kronolojik olarak yaşlanmış hücrelerde translasyon sentezini veya TLS'yi değerlendirebiliriz. Üç günlük stasyoner fazdaki vahşi tip ve SCH dokuz delta mutant hücrelerden alınan nükleer ekstraktlar analiz edildi.

Hasarsız şablonlu TLS ürünleri düz çizgilerle, hasarlı şablonlu TLS ürünleri ise noktalı çizgilerle gösterilmiştir. Uzun ömürlü s CH nine delta mutantının nükleer ekstraktlarında trans lezyon sentezi gözlemlenmemiştir; serbest primerler açık okla belirtilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, mayada kronolojik ömür ve DNA mutasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğine dair kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.