Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak sulu tamponlar içindeki DNA ve proteinler gibi biyomoleküllerin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu işlem, öncelikle görüntülenecek biyomoleküllerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, atomik kuvvet mikroskobu kurulur ve bir FM konsol probu konumlandırılır.

Ardından, numune yüzeyi ve ilgilenilen biyomoleküller görüntülenir ve analiz edilir. Nihayetinde, atom kuvvet mikroskobisi aracılığıyla tamponlanmış koşullarda DNA ve proteinlerin yanı sıra heterojen biyomoleküler komplekslerin genel boyutunu, miktarını ve organizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, moleküler şaperon alanındaki, şaperonlar ve ko-şaperon kompleksinin bir istemciye göre STO geometrisinin ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemin görsel demonstrasyonu faydalıdır, çünkü AFM ve Kent kol probu hazırlama adımları, büyük ölçüde fiziksel manipülasyonla ilgili karmaşıklıklar nedeniyle yazılı talimatlardan öğrenilmesi zor olabilir. Prosedürü laboratuvarımdan iki öğrenci olan Morgan Shannon ve John Gertz gösterecektir. Başlangıç olarak, görüntülenecek protein veya DNA moleküllerini izole edin ve bunları sulu bir tampon çözelti içinde süspande edin. Numunenin saflığını onayladıktan sonra, numunenin mikaya yapışmasını kolaylaştırmak için onu buz üzerinde bir AFM adsorpsiyon tamponunda inkübe edin.

Protein numuneleri için 10 milimolar HEPES tamponu kullanın. DNA için ise, AFM probunu monte etmek amacıyla 10 milimolar tris (pH 7,5), 10 milimolar sodyum klorür ve iki milimolar magnezyum klorürden oluşan magnezyum içeren bir tampon uygundur. Sıvı hücre prob tutucusunu karşılık gelen kantilever kurulum yerleştirme istasyonuna yerleştirin.

Görüntüleme için kullanılacak olan keskin nitrür kaldıraç probunun uzun ve kalın konsolunu belirleyin. Ucun dik kaldığından emin olarak, probu dikkatlice sıvı hücre prob tutucusuna aktarın. Ardından, konsolun sağlam olduğunu ve sıvı hücre prob tutucusuna düzgünce yerleştiğini doğrulamak için ışık mikroskobu altında inceleyin.

Ardından, nöral baş sıkıştırma vidasını sıkarak a FM başlığını cihazın kuyruk tertibatından dikkatlice çıkarın. a FM başlığını ters çevirin ve sıvı hücre prob tutucusunu a FM başlığının tabanındaki dört pine sıkıca itin. Son olarak, a FM başlığını cihazın kuyruk tertibatına dikkatlice geri yerleştirin.

Numuneleri görüntülemeden önce FM'yi daha fazla hazırlamak için, kantilever ucunu bulmak amacıyla yerleşik ışık mikroskobunun düğmelerini hareket ettirin; kantilever ucunu odak noktasına getirmek için yazılımdaki optik kontrolcünün yukarı ve aşağı oklarını ayarlayın. Lazeri kantilever ucuna hizalamak için lazer ayar düğmelerini kullanın. Bu, protokoldeki teknik açıdan en zorlayıcı adımlardan biridir. Konumlandırma manuel olarak yapılır ve hassas düğme ayarı gerektirir.

Yansıma noktasındaki ve aydınlatma noktasındaki lazerin dikkatle izlenmesi, başarılı hizalama olasılığını artırır. Ardından, foto detektörü merkezlemek için AFM başlığındaki foto detektör düğmelerini ayarlayın. Metal bir AFM numune diskine tutturulmuş, yeni koparılmış bir MICA tabakasını AFM tutucu plakanın üzerindeki mıknatıslı numune tutucuya yerleştirin.

Örnek diski ilk görüntüleme için konumlandırılacak şekilde a FM tutucu plakayı döndürün. a FM kafasını MICA örnek diskinin yüzeyine doğru aşağı hareket ettirmek için cihaz yazılımının odak yüzey kontrolünü kullanın. MICA yüzeyindeki belirgin özellikler veya uç yansıması odaklanana kadar, cihaz yazılımından tune simgesini seçin ve kantileveri optimize edin.

Önerilen MSNL veya SNL problarının rezonans frekansı 20 ila 60 kilohertz arasındadır. MICA örneğini görüntülemek için %5 pik offset seçin. İlk olarak, probu MICA yüzeyine yerleştirin, başlangıç tarama boyutunu 10 micrometers ve tarama hızını bir hertz olarak ayarlayın.

10 mikrometrelik alanın tam tarama görüntülerini yakalayın. Ardından tarama boyutunu 5 ve 0,5 mikrometreye düşürerek her bir alanın tam görüntülerini yakalayın. Cihaz yazılımındaki ayırma simgesine bir kez tıklayarak probu ayırın.

İlgilenilen biyomoleküllerin görüntülenmesi için, hazırlanan numunenin beş µL'sini 45 µL taze absorbsiyon tamponu ile karıştırın. 0,5 µg/mL biyomolekül içeren çözeltiden 50 µL'yi dikkatlice doğrudan MICU yüzeyine ekleyin. Numunedeki biyomoleküllerin Micah yüzeyine yapışması için beş dakika bekleyin.

Ardından, sıvı hücre prob tutucusuna 50 ila 100 µL ek absorbsiyon tamponu pipetleyin. Pipet ucuyla proba, FM kafasına veya MICA'ya dokunmamaya dikkat ederek, gerekirse foto detektörü yeniden ayarlayın ve lazeri kantileverle tekrar hizalayın. Daha sonra, probu yeniden devreye almak için cihaz yazılımını kullanın.

İlgi bölgelerini belirlemek için tarama boyutunu artırın. Görüntüleme tamamlandığında, probu ayırmak için cihaz yazılımındaki geri çekme simgesini birkaç kez seçin. Son olarak, sıvı hücre prob tutucusunu ve numune diskinile tamamen durulamak için distile su kullanın.

Ardından basınçlı hava ile deneyiniz. Burada bir AFM görüntüsü örneği gösterilmektedir. Mika alt katman, DNA ve proteinlerin absorbe olabileceği moleküler düzeyde düz bir yüzey sağlar.

Biyomolekül numunelerinden önce MICA'nın görüntülenmesi, negatif bir kontrol ve görüntüleme gürültüsünün değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, konsolun (cantilever) düzgün şekilde ayarlandığına ve sonraki numune görüntülemesinin başarılı olacağına dair bir güvence sunar. Muhtemelen süper kıvrımlı olan çift sarmallı plazma DNA'sı, asimetrik görünümü ve daha önce dikkat çekici özellikler taşımayan Micah substratı üzerindeki düzenli birikimi ile kolayca tanımlanır.

Belirli partikül boyutlarındaki protein kompleksleri, Micah substratından da benzersiz bir şekilde ayırt edilebilmektedir. Partikül boyutu farklılıkları numune heterojenliğini gösterir ve protein, kompleks stokiyometrik geometrisi veya biyokimyasal aktivitesinin yaklaşık olarak belirlenmesinde faydalı olabilir. Protein partiküllerinde genel olarak diyagonal şekil ve tutarlı yönelim gözlemlenmiştir.

Proteinlerin Micah substratı üzerinde beklendiği gibi rastgele bir şekilde yönlendirilmiş olmasından kaynaklanan bir görüntüleme artefaktı buradadır. Gözlemlenen artefaktın olası nedenleri; fiziksel bir uç anormalliği veya uc konvolüsyonunun x ve Y eksenindeki yükseklik ölçümü veya Z ekseni ile göreceli X ve Y ölçümlerinde mutlak uzunluk hesaplamalarını engellediği, çok hızlı bir tarama hızında gerçekleştirilen bir FM görüntüleme olabilir; buna rağmen bu ölçümler, görüntülenen biyomoleküllerin biyofiziksel özelliklerini tahmin etmek için yararlı olabilir. Bu prosedürü denerken, bu temel a FM prosedürünü takiben kantileverin doğru şekilde ayarlanması ve foto dedektörün hizalanmasının hatırlanması önemlidir.

Moleküler şaperonların, steroid reseptörlerinin DNA yanıt elementlerinden salınımı üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için tampon değişim sıvı hücresi kullanımı dahil olmak üzere diğer adımlar eklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, tamponlu koşullar altında atomik kuvvet mikroskopi kullanarak DNA proteinlerinin ve biyomoleküler komplekslerin nasıl görüntüleneceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.