Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

[Anlatıcı] Bu protokol; bakteri ve faj gibi mikroorganizmaları izole etmek, çoğaltmak veya saymak için kullanılan ekim yöntemlerinde aseptik tekniği kapsamaktadır. Prosedürler arasında tekil kolonileri izole etmek için bakteri kültürlerinin çizgi ekimi, bakteri konsantrasyonunu belirlemek için dökme plak yöntemi ve canlı bakteri kolonilerini saymak için yayma plak yöntemi yer almaktadır. Fajları izole etmek ve plakları saymak için yumuşak agar kaplamaları kullanılırken, replika ekim ile hücreler bir plakdan diğerine aynı uzamsal düzende aktarılır. Nihayetinde, mikroorganizmaları kültürleme için bu tekniklerin pratik uygulamaları, çevredeki bakterilerin tanımlanmasından moleküler genetikteki teknolojik gelişmelere ve yüksek kapasiteli biyolojik analizlere kadar geniş bir yelpazeye yayılmaktadır.

- Genel olarak, bu ekim yöntemlerinde yeni olan kişiler, manipülasyonların steril olmayan yüzeylerle temastan kaçınan dikkatli ve koordineli hareketler gerektirmesi nedeniyle zorlanabilirler. Bu rutin prosedürlerin öğrenilmesi eğitim ve pratik gerektirir. Prosedürleri laboratuvar koordinatörüm Dr. Kris Reddi uygulamalı olarak gösterecektir.

- [Anlatıcı] Mikroorganizmalarla çalışmaya, biyotehlike sınıflandırması, atık dekontaminasyonu ve bertarafı dahil olmak üzere laboratuvar kurallarını ve güvenlik önlemlerini bilerek başlayın. Ekime yönelik tüm aletlerin, solüsyonların ve besiyerlerinin steril olduğunu onaylayın. Ayrıca temiz bir çalışma alanı oluşturun. Burayı dezenfektan ile temizleyin. Gaz hattına bağlı bir tüp ile bir Bunsen beki kurun, gerekli malzemeleri uygun şekilde etiketlenmiş olarak düzenleyin. Ardından elleri antiseptik sabun ve ılık suyla iyice yıkayın. Önce elleri ılık, akan suyla ıslatın, ardından sabunu uygulayın ve iyice yayın. Başparmaklar, parmak arkaları, el sırtları ve tırnak altları dahil tüm yüzeylerde sürtünme oluşturarak elleri kuvvetlice ovun. Ardından kalıntı sabunu gidermek için iyice durulayın ve bir tutucudan alınan kağıt havlularla kurulayın. Son olarak, temiz bir kağıt havlu ile musluğu kapatın. Çizgi ekim prosedürü, karışık popülasyonlardan bakteri saf kültürlerini veya kolonilerini basit mekanik ayırma yoluyla izole etmek için tasarlanmıştır. Bir agar plakayı 4 °C'lik soğuk kutudan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar ön ısıtmaya bırakın. Plakayı çizmek için mevcut aletler arasından bir araç seçin. Plakanın kuru olduğundan ve kapakta yoğuşma olmadığından emin olun. Bir agar plakanın alt kısmını kenar boyunca etiketleyin. Yetkinleştiğinizde, birden fazla örnek için tek bir plaka kullanın. Ardından, metal özi kararını yakmak için bir Bunsen beki ateşleyin. Teli, Bunsen beki alevinin en sıcak kısmı olan mavi koninin ucunda tutarak, metal öze ile arasında üç ila dört inç mesafe bırakarak başlayın. Metal kızardığında, alevin öze yaklaştığı şekilde teli hareket ettirin. Özi soğutmak için, cızırtı sesi oluşturacak şekilde agar besiyerinin kenarına dokunun. Öze ile inokülumu almaya devam edin. Plakanın alt yarısını kaldırın. Plakanın birinci kuadrantında, özi kenardan merkeze doğru ileri geri hareket ettirin. Ters çevrilmiş plakayı tekrar kapağının üzerine koyun. Metal özi tekrar yakın. Petri kabını 90 derece döndürün. Özi, ileri geri desenini kullanarak son çizginin sonuna yakın bir yere dokundurun, birinci kuadranttaki çizgilerin son yarısının üzerinden geçin, ardından boş olan ikinci kuadranta geçin. İkinci kuadrant dolduğunda plakayı yere koyun. Birinci kuadrantla temastan kaçınarak üçüncü ve dördüncü kuadrantlar için ekim prosedürünü tekrarlayın. Steril, düz bir kürdanla ekim yapmak için, kürdanın ince ucunu başparmak ve yüzük parmağı arasında besiyerine 10 ila 20 derecelik bir açıyla nazikçe tutun, kuadrantları çizmek için geniş ucu kullanın. Kuadrantlar arasında plakayı tekrar kapağının üzerine ters çevirin ve kürdanı uygun şekilde bertaraf edin. Ekilen plakaları ters şekilde inkübe edin. Dökme plaka prosedürü, tek bir plakanın agar yüzeyindeki ve içindeki toplam koloni oluşturan birim sayısını belirler. 10 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın, ardından 55 °C'lik su banyosundaki 18 mL eritilmiş agar besiyerini 48 °C'lik bir ısıtma bloğuna aktarın ve 10 dakika boyunca dengeleyin. Steril bir petri kabının altını etiketleyin. Varsa, dilüsyon faktörünü ekleyin. Şimdi, petri kabının ortasına bir mL örnek dağıtın. Kapağı kapatın. Eritilmiş agar tüpünün kapağını çıkarın ve açık tüpün ağzını alevden geçirin. Agarı dikkatlice petri kabına dökün. Kapağı kapatın, ardından plakayı nazikçe dairesel hareketlerle sallayarak örneği agar ile karıştırın. Agarın katılaşması için 30 dakika bekleyin. Agar katılaştıktan sonra, plakayı ters çevirip sıcak bir odaya yerleştirin. Yayma plaka yöntemi, küçük bir örnek hacminde bulunan mikroorganizmaları ayırmayı ve ortaya çıkan kolonileri agar yüzeyine eşit şekilde dağıtmayı amaçlar. Bir plakayı oda sıcaklığında dengeleyin ve uygun şekilde etiketleyin. Plakayı döner tablaya yerleştirin. Agarın merkezine 0.1 mL örnek pipetleyin ve kapağı kapatın. Pipet ucunu bir atık konteynerine atın. Metal çubuğu, yayıcının tüm alt kısmını ve sapın ilk bir inçlik bölümünü kaplayacak şekilde %70'lik etanol içeren bir behere daldırın ve ardından süzün. Fazla etanolü bir Bunsen beki alevinden geçirerek yakın. Ardından, agar plakanın kapağını açın ve yayıcıyı, kenara yakın agar kısmına dokundurarak soğutun. Döner tabloyu yavaşça döndürün. Yayıcıyı agar yüzeyinde nazikçe tutarak, döner tabla dönerken örneği ileri geri hareketlerle tüm plaka üzerine kademeli ve eşit şekilde yayın. Kapağı kapatın ve örneğin tamamen emilmesi için en az beş dakika bekleyin. Ardından, ters çevrilmiş plakayı inkübe edin. Önce, agar plakayı uygun şekilde etiketleyin. Agar plakanın kapağını açın. Ardından önceden sterilize edilmiş cam boncuklar kabını açın ve ağzını yakın. Agar plaka üzerine dikkatlice 10 ila 12 adet steril cam boncuk yerleştirin. Plakanın kapağını kapatın ve kapağı geri takmadan önce cam boncuk kabının ağzını yakın. Şimdi, örneği agarın merkezine pipetleyin. Yatay bir hareketle, boncukları agar yüzeyinde yedi kez nazikçe sallayın. Doğru yapıldığında, prosedür marakas sallama sesine benzer. Plakayı 60 derece döndürün ve tekrar yatay olarak yedi kez sallayın. Tekrar plakayı 60 derece döndürün ve sallama işlemini tekrarlayın. Örneğin emildiğini doğrulayın. Ardından, kontamine olmuş boncukları %10'luk klorlu çamaşır suyu içeren işaretlenmiş bir toplama beherine boşaltın. Ters çevrilmiş plakayı inkübe edin. Plak assay, genellikle bakteriyofajları tespit etmek ve miktarını belirlemek için kullanılır. İndikatör bakterileri eksponansiyel faza kadar kültüre edin ve buz üzerinde saklayın. Ardından, iki steril mikrosantrifüj tüpünü faj ve kontrol olarak etiketleyin ve her birine sırasıyla 50 µL faj örneği veya tampon ekleyin. Sonra, flasktaki bakteri kültürünü çalkalayın, ardından bir miktar bakteriyi steril bir tüpe aktarın ve indikatör bakterileri nazikçe vorteksleyin, sonra her absorbsiyon tüpüne 500 µL bakteri ekleyin. Tüpleri nazikçe tıklatarak karıştırın. Faj örneklerini asla vortekslemeyin veya kuvvetlice pipetlemeyin. Faj-bakteri karışımını, indikatör suşu için uygun bir sıcaklıkta 20 dakika inkübe edin. Bu sırada, iki yumuşak agar tüpünü 55 °C'lik su banyosundan 48 °C'lik ısıtma bloğuna aktarın. 10 dakika boyunca dengeleyin. Oda sıcaklığında önceden dengelenmiş, yoğuşmasız iki besiyerli sert agar plakayı etiketleyin. Yumuşak agar tüpünü ısıtma bloğundan çıkarın ve içeriğin dokunulmayacak kadar sıcak olmadığını kontrol edin. Ardından, faj absorbsiyon tüpündeki karışımı aseptik olarak yumuşak agar tüpüne aktarın. Sonra, içeriği karıştırmak için avuç içleri arasında hızla döndürün. Tüp bir elinizdeyken, diğer elinizle sert agar plakanın kapağını açın. Tüpün tüm içeriğini hemen sert agar plakanın yüzeyine dökün. Plakayı hızla ve nazikçe sallayın. Kapağı kapatın ve yumuşak agar katılaşana kadar plakayı 30 dakika boyunca düz bir zemine yerleştirin. Ardından, kontrol karışımını yumuşak agar tüpüne aktararak, karıştırarak, içeriği sert agar plakaya dökerek, sallayarak ve yumuşak agarın 30 dakika katılaşmasını sağlayarak prosedürü kontrol absorbsiyon tüpü için tekrarlayın. Plakaların plak oluşumu açısından incelemesi yapın. Heterojen bir karışımdan bir plağı izole etmek için, merkezini steril bir kürdanla dikkatlice delin ve inokülumu 100 µL faj tamponu içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gerektiğinde seri dilüsyonlar yaparak plak assay'ini üç ila altı kez tekrarlayarak bu lizatı saflaştırmaya devam edin. Replika plakalama, hücre büyümesinin bir primer plaka ile sekonder plakalar arasında karşılaştırılmasına izin vererek seçilebilir bir fenotipten yararlanır. Plakanın altına bir ızgara çizin, primer plakayı etiketleyin ve ortaya çıkan kareleri numaralandırın. Şimdi, aseptik teknik kullanarak beherden önceden sterilize edilmiş bir kürdan çıkarın, her karenin merkezine bir hücre örneğiyle dokunun ve kürdanı uygun bir atık kutusuna atın. Primer plakayı inkübe edin. Primer plakayı ve tüm sekonder plakaları üst üste dizin. Plakaların alt yarısının yan tarafına bir yönlendirme işareti koyun. Şimdi, steril bir kadife kumaşı ambalajından çıkarın ve silindirik blok üzerine yerleştirin. Ardından, tutucuyu, üzerindeki işaretleri bloktaki işaretlerle hizalayacak şekilde yerleştirin. Blok ve tutucu üzerindeki yönlendirme işaretini not edin. Ardından, primer plakanın kapağını çıkarın. Plaka ve blok üzerindeki yönlendirme işaretlerini hizalayın. Plakayı, agar yüzeyi kadife kumaşa temas edecek şekilde indirin. Parmak uçlarınıyla primer plakanın arkasına hafifçe ancak eşit şekilde bastırın ve ardından plakayı dikkatlice bloktan kaldırın. Hücrelerin izinin kadife üzerinde görülebildiğini onaylayın. Plakanın kapağını tekrar kapatın. Şimdi, kadife kumaş üzerindeki protokolü her bir sekonder plaka ile sırayla tekrarlayın. Primer plakadan gelen hücrelerin kadife izini, en az uygundan en uygun substrata doğru sıralanmış sekemize kadar sekiz sekonder plakaya inoküle etmek için kullanın. Son olarak, pozitif kontrol olarak, serideki son plaka için, test edilen tüm suşların büyümesi gereken agar besiyerini kullanın. Ters çevrilmiş plakaları birlikte bantlayın ve inkübe edin. Sekonder plakaları büyüme açısından inceleyin. Bunsen beki kapatın ve ardından tüm malzemeleri kaldırın. Kontamine laboratuvar ekipmanlarını, cam eşyaları ve tehlikeli atıkları uygun bertaraf kabına yerleştirin. Çalışma alanını dezenfektan ile temizleyin. Son olarak, elleri antiseptik sabun ve ılık suyla iyice yıkayın. Serratia Marcescens, prodigiosin adı verilen kırmızımsı bir pigment üreten, gram negatif, çubuk şeklinde bir proteobakteridir. Genellikle banyolarda ve duş perdelerinde büyürken bulunur. Bu örnekte, çizgi ekim tekniği dördüncü kuadrantta tekil koloniler oluşturur. Bir halka içme çeşmesinden toplanan su örneğinde bulunan bakterilerin bu analizi, Dökme Plaka tekniğini kullanır. Kolonilerin görünümündeki farka dikkat edin. Yüzey kolonileri büyük ve dairesel şekilliyken, bazı yüzey kolonileri çok küçük ve düzensiz şekillidir. Yayma Plaka tekniği, zenginleştirme, seçme ve tarama deneylerinin önemli bir bileşenidir. Örneğin, copacabana yöntemi, rekombinant DNA teknolojisindeki klasik mavi-beyaz taramada ayırt edici bir araçtır. Faj T4, konakçısı olan Escherichia coli'yi enfekte ederek lizis yapan ve yavru fajları salan virulent, çift sarmallı bir DNA fajıdır. EHA agar üzerindeki bu plak assay, yaklaşık bir milimetre çapındaki berraklaşma bölgelerinde fajları gösterir. Enfekte eden faj partikülleri yokluğunda, bakteriyel büyüme, belirgin kolonilerin görünmediği, yumuşak agarda bulanık bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır. Yumuşak agar kaplama tekniğinde, plak morfolojileri farklılık gösterir. Örneğin, burada aynı mycobacterium konak suşu, microbacteria faj imha edicilerinin varlığında mycobacteria faj MSSS'ye kıyasla farklı plak morfolojileri üretir. Replika plakalama yöntemi, çok sayıda mikroorganizmanın eş zamanlı taranmasında güçlüdür. Bu durumda, dört pseudomonas suşu, üç farklı karbon kaynağı üzerinde büyüme açısından çift olarak test edilmiştir: Asetamid, laktoz ve glisin. Burada primer plaka, belirtildiği gibi dört suş ile inoküle edilmiş tam bir YTA besiyeridir. Suşlar, tek bir karbon kaynağı (asetamid, laktoz veya glisin) ile takviye edilmiş minimal MSA besiyeri replika plakalarında değişken büyüme modelleri göstermektedir. Tüm suşlar son pozitif kontrol plakasında büyümekte olup, bu durum hücrelerin bu serideki tüm sekonder plakalara aktarıldığını onaylamaktadır. Bu replika plaka sonuçlarının tablolaştırılması, farklı vahşi tip suşların karakteristik büyüme gereksinimleri için eş zamanlı taramasını detaylandırmaktadır.

- Bu videoyu izledikten sonra, besiyerlerini veya kültürleri kontamine etmeden ekim prosedürlerini nasıl gerçekleştireceğiniz ve laboratuvardaki herhangi bir deneysel görev için uygun ekim yöntemini nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu tekniklerde yetkinleşmek pratik gerektirir. Ancak, uygun eğitimle, bu videoda açıklanan ekim prosedürleri laboratuvar tezgahında çalışırken sizin için doğal bir alışkanlık haline gelecektir.