Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Bu prosedürün genel amacı, treg fonksiyonunu ölçmek ve potansiyel olarak fonksiyonlarındaki gelecekteki kayıpları öngörmek için in vitro bir insan supresyon testi kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle hücre stimülatörleri olarak kullanılacak kodlanmış boncukların hazırlanması ve test edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım; saf naif CD4 pozitif CD25 negatif T hücrelerini, in vivo aktive edilmiş CD4 pozitif CD25 düşük T hücrelerini ve regülatör CD4 pozitif CD25 yüksek T hücrelerini izole etmek ve bunları antijen sunan hücreler veya APC'ler olarak kullanılmak üzere ışınlanmış PP BMC'leri ile birleştirmektir.

Ardından, yanıtlayıcılar olarak naive veya aktive edilmiş T hücreleri ve APC'ler olarak P BMC'leri ile tekli kültürler veya aynı koşullar altında, ancak 1:10 oranında treg eklenmiş ko-kültürler kurulur. Son adım, hücrelerin hasat edilmesi ve tritiyumlu timidinin inklüzyonu ile proliferasyonlarının ölçülmesidir. Nihai olarak elde edilen sonuçlar, naive hücrelere karşı in vivo aktive edilmiş T hücre yanıtlarının baskılanmasındaki farkları ortaya koyabilir.

Benim adım Jeff Woodcliff. Düzenleyici T hücreleri kendine özgü hücre yüzeyi belirteçleri eksprese etmezler. Bu nedenle, fonksiyonlarını güvenilir bir şekilde ölçebilmek için, en iyi ayrımı sağlayan teknikler kullanılarak izole edilmeleri gerekir.

Fluoresan aktivasyonlu hücre ayıklamanın (FACS), manyetik izolasyon gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, FACS ile elde edilebilen saf hücre popülasyonlarıdır. Böylece, burada gösterildiği gibi, hücre fonksiyonları in vitro baskılama deneylerinde güvenilir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, sağlıklı bireylerde ve tip 1 diyabetle ilişkili deneklerde Treg fonksiyonları hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, insan romatoid artriti, sistemik lupus eritematozus, multipl skleroz ve diğer otoimmün hastalıklara da uygulanabilir. T-hücre aktivasyon boncuklarını anti-insan CD3 ile kaplamak için.

Orijinal şişeden bir mililitre M four 50 toil aktive edilmiş boncuğu 1,5 mililitrelik bir tüpe ekleyin ve tüm boncuklar tüpün kenarına yapışana kadar tüpü manyetik standa yerleştirin. Ardından, tüp hala manyetik standdayken boncuk tamponunu pipetleyerek uzaklaştırın. Daha sonra tüpü manyetik standdan çıkarın ve bir mililitre tampon bir ekleyin.

Tüpü tekrar tekrar manyetik standa yerleştirin. Tüp manyetik standayken tamponu uzaklaştırın. Boncukları bir mililitre tampon 1 içerisinde yeniden süspande edin.

Bu sefer aynı zamanda 40 µL anti-human CD3 ekleyin. Boncukları ve antikoru 37 °C'de 15 dakika boyunca ajite edin. Ardından %0,1 (ağırlık/hacim) BSA ekleyin ve sonraki 16 saat boyunca ajitasyona devam edin.

Ardından, boncukları bir mililitre tampon iki içerisinde, 2 ila 8 °C'de beş dakika inkübe ederek ve ardından tüp manyetik standdayken tamponu uzaklaştırarak iki kez yıkayın. Daha sonra boncukları aynı steril koşullar altında bir kez daha yıkayın.

Bu kez bir mililitre tampon üç kullanarak, optimal oranı belirlemek amacıyla hücre başına değişken sayıda CD3 kaplı boncuk ekleyip antikor kaplama verimliliğini test edin ve 96 kuyucuklu bir plakada her kuyucuğa üç tekrarlı olarak 50.000 PBMC ekleyin. 37 °C'de 72 saatlik kültürlemenin ardından, bir mikrokuri trityumlanmış timidin ekleyin ve inkübasyona sonraki 16 saat boyunca devam edin. Hücreleri çoklu ekran hasat plakası veya benzeri bir kapla toplayın.

Sintilasyon sıvısı ekleyin ve kuyuk başına dakika başına sayımı veya CPM değerini okuyun. Bir TopCount NXT sintilasyon sayacı veya benzeri bir cihaz kullanarak boncuk/hücre oranını belirleyin; deneyimlerimize göre, tutarlı bir şekilde 5.000'in üzerinde ancak 15.000'in altında bir CPM veren oranı seçin. Hücre başına üç boncuk oranı, test edilen tüm insan deneklerde hem yanıtlayıcı hem de Treg hücreleri için genellikle optimal stimülasyonu sağlar.

50 mililitrelik konik bir tüpü 15 mililitre fal plus ile doldurun. Ardından, kan tüpüne 250 mililitre PBS ekleyerek 50 mililitre buffy coat'un bire altıya seyreltmesini gerçekleştirin. Seyreltilmiş buffy coat'un 25 mililitresini, katmanları bozmadan yavaşça fial pack'in üzerine katmanlar halinde ekleyin.

4 °C'de 30 dakika boyunca 800 ×g'de santrifüj edin. Freni kapatarak, fial ile tampon arasındaki beyaz ara faz olan PBMC tabakasını dikkatlice toplayın. Gerekirse, tüpün çeperindeki hücreleri sıyırarak alın.

Birkaç dakika bekleyin ve hücreleri ara fazdan tekrar toplayın. Hücreleri taze 50 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri PBS ile doldurup santrifüj ederek pellet haline getirip yıkayın. PBM cs.

Yıkama adımını her seferinde iki kez tekrarlayın. İki hücre peletini tek bir tüpte birleştirerek, nihayetinde tüm hücre peletlerini tek bir 50 ml tüpte toplayın. Ardından, tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücre canlılığını belirlemek için süspansiyon halindeki hücrelerden 20 µL kullanın.

Canlı pbmc'den bir mililitreyi yeni bir tüpe aktararak test APC'lerini oluşturun. Ardından dört mililitre besiyeri ekleyin ve hücreleri 5.000 rad ile ışınlayın; geri kalan PBMC'leri içeren tüpü PBS tamponu ile tamamlayın. Daha sonra hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 250 ×g'de santrifüj ettikten sonra süpernatantı dökün ve hücreleri aynı karışımın dört mililitresinde yeniden süspanse edin.

Ardından, PBMC'lere 200 µL max anti CD4 mikroboncuğu ekleyin ve hücre-boncuk karışımını 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri 40 mL PBS tamponuyla yıkayın ve ardından hücreleri pelletleyin. Daha sonra süpernatantı dökün ve hücreleri oda sıcaklığında 8 mL Degas PBS tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından, hücre süspansiyonunu ayırmak için ön ayırma filtreleri kullanın. Daha sonra PBM CS'yi iki adet 15 mililitrelik tüpe bölün. Her bir tüpe dört mililitre P BMC ekleyin.

İki sütunu minimax ayırıcıya kalın bir yapıştırıcı ile sabitleyin ve her sütunun altına toplama tüpleri yerleştirin. Ardından, her sütuna üç mililitre DGAs PBS tamponu ekleyin; tampon tükendiğinde, hücre süspansiyonu tamamen bitmeden önce her tüpteki dört mililitrelik hücre solüsyonunun tamamını sütunların üzerine katmanlar halinde ekleyin. Her sütuna üç mililitre oda sıcaklığında DGAs PBS tamponu ekleyin ve tamponun toplama tüplerine akmasını bekleyin.

Berrak bir görünüm elde edene kadar daha fazla tampon ekleyin. LS kolonlarına beş mililitre daha DGAs tamponu pipetleyin ve ardından LS kolonlarını minimax separatörden çıkarın. Kolonları yeni steril 50 mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin.

Yarım mililitrenin dışarı akmasına izin verin ve ardından geri kalan yaklaşık dört mililitrelik hacmi yavaşça dışarı itin. Şimdi iki CD4 pozitif fraksiyonu birleştirin. Ardından tüpe 50 mililitreye kadar PBS ekleyin ve hücreleri 4 °C'de, 10 dakika boyunca 400 ×g'de santrifüj ettikten sonra hücreleri sayın.

Hücreleri iki mililitre PBS tamponu içinde yeniden süspande edin. Fakt boyaması için kullanılacak antikorları tek bir tüpte birleştirin: anti CD 14, CD 32, CD 16 ve isteğe bağlı olarak anti CD 4. FLOROKROM eksi bir tüpünü boyamak için karışımdan bir alikot alın.

Hücre süspansiyonundan beş µL'yi bir fax tüpüne aktararak FMO tüpünü hazırlayın ve hücreleri önceden hazırlanmış antikor kokteylinden iki µL ile boyayın. Ardından, hücre ayırma için kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere, tek bir florokrom ile boyanacak olan boyanmamış hücreleri ve mouse IgG kaplı boncukları yeni bireysel fax tüplerine ekleyin. Daha sonra kokteyle 50 µL anti-human CD 25 PE ekleyin ve kokteyli hücre süspansiyonunun geri kalanına ilave edin.

Tüpleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri antikor kokteyli ile inkübe ettikten sonra, hücrelere PBS tamponu ekleyin ve ardından onları çöktürün. Çökelti, 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda PBS tamponu içinde süspande edin.

CD 25 pozitif T hücrelerinin ayıklanması için eşik değerini belirlemek amacıyla FMO tüpünü kullanın. Bu kapılama stratejisini kullanarak, öncelikle bu şekilde gösterildiği üzere monositleri, makrofajları ve diğer tüm CD 4 pozitif T dışı hücreleri kapsayan fitz pozitif hücreleri dışlamak için fitz negatif hücrelerin etrafına bir kapı belirleyin. Ayrı bir grafikte, bu şekilde olduğu gibi CD 25 negatif ve CD 25 düşük T hücreleri ile CD 25 yüksek treg hücreleri için kapılar çizin.

Akış sonrası hücre alt kümeleri sıralandıktan sonra, toplama tüplerini santrifüj ederek çöktürün ve T-hücrelerini ekim yapana kadar buz üzerinde tutun. U tabanlı 96 kuyucuklu bir plakayı tabloda gösterildiği şekilde etiketleyin. 96 kuyucuklu plaka içerisindeki %10 havuzlanmış insan AB serumlu tam medyuma, kuyucuk başına yanıt veren hücre başına üç boncuk konsantrasyonuna göre hesaplanmış 50 µL CD3 kaplı boncuk alikotunu süspande edin; ardından daha önce ışınlanmış APC'leri medya içerisinde 5 × 10⁵ hücre/ml konsantrasyonuna seyreltin.

96 kuyucuklu plakaya 50 µL hücre ekleyin ve ardından her kuyucuğa üç tekrarlı olarak 2,5 × 10⁴ CD4⁺ CD25⁻ veya CD4⁺ CD25ˡᵒ T hücresi ekleyin; Treg hücrelerini B sırasına ve burada gösterildiği gibi ko-kültürdeki "sadece Treg" olarak etiketlenmiş kuyucuklara 1:10 oranında ekleyin. Ardından plakayı, %5 CO₂ içeren ve doygun neme sahip bir inkübatörde 37 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, ko-kültürün son birkaç saatinde hücreleri 1 µCi tritiyumlanmış timidid ile pulse edin ve timidid hücrelere dahil olduktan sonra inkübasyona 37 °C'de sonraki 16 saat boyunca devam edin.

Çoklu ekranlı bir toplama plakası üzerindeki hücreleri toplamak için bir filtre mate hasat cihazı kullanın. Ardından, toplama plakasını önceden sintilasyon sıvısı ile doldurulmuş şeffaf plastik bir kapakla kapatın. Son olarak, kuyucuk başına CPM değerini okuyun.

Bir sintilasyon sayacı kullanılarak, aşağıdaki nokta grafikleri serisinde görüldüğü üzere T hücre alt kümeleri bu sistemle yüksek saflıkta izole edilebilir; CD 4 pozitif CD 25 negatif T hücreleri burada alt kapıda gösterilmiştir. Bir sonraki şekilde, yüksek saflıkta CD 4 pozitif CD 25 düşük T hücreleri görülebilir. Akışla sıralanmış saf bir CD 4 pozitif popülasyonu.

CD 25 yüksek treg hücreleri üst kapı kontrolünde gösterilmiştir. Sağlıklı deneklerden alınan APC'lerin ve treglerin tek hücre tipi kültürleri, timidin inklüzyonu ile ölçüldüğünde arka plan değerinin üzerinde çok az veya hiç proliferasyon göstermemiştir; buna karşın, naif CD 25 negatif ve in vivo aktive olmuş CD 25 düşük T hücreleri, bu yanıt verici hücre tipleri treg hücreleri ile birlikte kültüre edildiğinde baskılanan belirgin bir proliferasyon sergilemiştir. Bununla birlikte, treglerin yanıt verici naif CD 25 negatif ve in vivo aktive olmuş CD 25 düşük T hücrelerini baskılama kapasitelerinde hafif farklılıklar gözlemlenmiştir.

Kontrol grubu anlamlı değildi. Risk altındaki deneklerden alınan APC ve Treg hücrelerinin tek hücre tipi kültürleri, timidin inklüzyonu ile ölçüldüğünde arka plana kıyasla çok az proliferasyon göstermiş veya hiç göstermemiştir. Buna karşın, naif CD 25 negatif ve InVivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücreleri, sağlıklı kontrollere kıyasla daha düşük proliferasyon seviyeleri sergilemiştir.

Deney güvenilir sonuçlar ürettiği için, yanıt veren T hücrelerinin treg'ler ve ko-kültürler tarafından daha fazla baskılandığı görülmüştür. Ek olarak, düşük CPM değerlerinin sinyal iletiminde potansiyel kusurlara işaret ettiği sonucuna varılabilir ve bu durum farklı bir çalışma türünde daha detaylı incelenmelidir. Bununla birlikte, risk altındaki deneklerde treg'lerin CD 25 negatif yanıt veren T hücrelerine kıyasla CD 25 düşük yanıt veren T hücrelerini baskılama kapasitesindeki fark anlamlıydı.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı deneklerde ve tip 1 diyabetli denekler gibi bağışıklık sistemi yetersizliği olan deneklerde Treg varlığına yönelik başarılı ve güvenilir bir fonksiyonel test için gerekli tüm adımların nasıl sorunsuz bir şekilde birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.