Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, hücre çekirdeği arayüzünün mekanik özelliklerini ve çevredeki hücre iskeleti ile olan fiziksel bağlantısını ölçmektir. Bu işlem, şeffaf bir silikon membran üzerine ekilmiş hücrelere mekanik gerinim uygulanarak ve ortaya çıkan nükleer deformasyonların görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Çekirdek ve hücre iskeleti arasındaki etkileşimdeki değişiklikler de indüklenen nükleer deformasyonları etkileyebildiğinden, artan nükleer deformasyonlar azalmış nükleer sertliğe karşılık gelir.

Sitokelet ile çekirdek arasındaki hücre içi kuvvet iletimi, sitokelete lokalize gerilme uygulanarak doğrudan incelenir. Ardından, floresanla işaretlenmiş NU çekirdek ve sitokelet yapılarının yer değiştirmesi görüntülenir. Hücre çekirdeklerinin çevreleyen sitokelete göre sertliğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Substrat gerinim deneylerine dayanarak, mikroiğne manipülasyon analizi, nükleo-sitoskelet etkileşiminin bozulmasının hücre içi kuvvet iletiminde kusurlara yol açtığını ortaya koymaktadır. Bu tekniklerin, izole çekirdeklerin mikro pipet aspirasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, normal hücresel mimariyi bozmadan, canlı ve sağlam hücrelerin çekirdek mekaniği ölçümlerine olanak sağlamalarıdır. Bu yöntemler, nükleer zar bileşimindeki değişikliklerin çekirdeğin mekanik özelliklerini nasıl etkileyebileceğine dair içgörü sağlayabilir.

Bunlar ayrıca, LA nöropatileri veya kanser gibi hastalıklar bağlamında nükleer mekaniğin rolünü incelemek için de uygulanabilir. Her gerilme kabı, üç inç çapında özel yapım altı açık plastik bir kap ile hücre kültürü substratı olarak hizmet eden silikon bir membranı tutmak için kullanılan plastik bir O-ringden oluşur. Gerilme kabının hazırlanması için, dört inç boyutunda kare şeklinde bir silikon membran parçasını bir O-ring ile kabın arasına sıkıştırın, fazla membranı dikkatlice kesin, gerilme kabını deiyonize suyla durulayın ve ardından silikon membranı hücre dışı matris molekülleri ile kaplamadan önce kabı otoklavlayın; membranın dış kısmının alt orta noktasına bir referans noktası işaretleyin.

Bu işaret, tek eksenli gerinim uygulaması için gerçekleştirilen gerinim deneyleri sırasında aynı hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Membran oluşumunu tek bir boyutta sınırlamak için referans noktasının etrafına iki paralel şerit halinde scotch bant uygulanır. Optimal hücre yapışmasını sağlamak için, silikon membranları mililitre başına üç mikrogram fibronektin veya uygun herhangi bir hücre dışı matriks proteini ile kaplayın.

Suş kabını ters çevrilmiş 10 santimetrelik bir polistiren kapla kapatın ve ertesi güne kadar dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Fazla proteini uzaklaştırmak için membranı bir kez PBS ile durulayın. Kabı 10 mililitre büyüme besiyeri ile doldurup kenara ayırın.

Kaplanmış silikon membran kap hazırlandıktan sonra, hücreler %0,05 tripsin ile tripsine edilir ve yapışkan hücreler büyüme ortamı içeren kabın üzerine ekilir. Bu prosedür fare embriyonik hücreleri kullanılarak gösterilmiştir.

Fibroblastlar veya mes hücrelerini normal kültür koşulları altında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Substrat gerilme deneyleri için donatılmış bir ters mikroskop, mikroskop tablasına oturan bir taban plakasından oluşan bir gerilme cihazı içerir. Plaka, silikon membranın merkezi bölümüne gerilme uygulamaya yarayan merkezi silindirik bir platini tutar.

Cihaz ayrıca, gerilme kabını tutan ve dört kılavuz pim üzerinde yukarı ve aşağı kayabilen hareketli bir plakaya ve yük uygulamak için beş poundluk bir ağırlığa sahiptir. Çekirdekleri görselleştirmek için, gerilme kabındaki hücreleri mililitre başına bir mikrogram Hoechst boyası ile 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, besiyerini aspire edin ve yerine 25 mM HEPES içeren, fenol kırmızısı içermeyen 15 mL büyüme besiyeri ekleyin.

Ardından, kabı kap holderine vidalayın ve silikon membranın merkezi Platin boyunca kaymasını sağlamak için membranın alt kısmının çevresine dikkatlice gres sürün. Membranın orta kısmının temiz kaldığından emin olun. Taban plakasını mikroskop tabla plakası üzerine yerleştirin ve kap holderini dikkatlice taban plakasına monte edin.

Başlangıç dinlenme pozisyonunda, gerilme tabağının silikon membranının merkez platin üzerinde gevşekçe durduğundan emin olun. Ardından, silikon membranının altına odaklanın ve merkezdeki siyah referans noktasını bulun. Bu nokta, tüm görüntüleme işlemleri için başlangıç noktası işlevi görecek ve gerilme sırasında ve sonrasında aynı hücrelerin konumlandırılmasına yardımcı olacaktır.

Bu görüntüde, merkezi nokta görüş alanının tamamını doldurmaktadır. Noktanın kenarından başlayarak, hücreleri ve silikon membranın üst kısmını görüntülemek için odağı ayarlayın. Çekirdekleri merkezde konumlanmış, iyi yayılmış hücreleri bulun.

Hücre ana hattına ve silikon membrana odaklanan bir yüzey kontrast görüntüsü elde edin. Ardından, çekirdeğin merkez düzlemine odaklanarak nükleer kanca boyamasının floresan görüntüsünü alın. Beş ila 15 hücrenin görüntülerini elde ettikten sonra, merkezi noktaya geri dönün.

Tekdüze bir gerilme uygulaması sağlamak amacıyla, ağırlığı gerilme kabına yavaşça uygulayın. Kabın merkezinde, uygulanan maksimum substrat gerilmesi, dikey hizalama pimleri üzerine yerleştirilen naylon ara parçalarla sınırlandırılmıştır; gerilme uygulamasının ardından silikon membranın altına odaklanın ve referans noktayı tekrar bulun, işleme noktadan başlayın.

Aynı hücreleri tekrar konumlandırın ve her bir hücrenin çekirdeğinin tam gerilim altındaki faz kontrast ve floresan görüntüsünü, başlangıç görüntülerinin odak düzlemleriyle yakından eşleşmeye çalışarak edinin. Hücrenin yabancı substrata aktif yeniden şekillenmesini ve adaptasyonunu önlemek için bu işlem 10 dakikayı geçmemelidir. Tüm karşılık gelen görüntüler elde edildikten sonra, mikroskop tablasını başlangıç noktasına geri getirin.

Ağırlığı kap tutucu plakadan dikkatlice kaldırın ve gerekirse silikon membranın gevşemesine izin verin. Süzme kabını başlangıç konumuna gelene kadar nazikçe yukarı itin. Ardından faz kontrast ve floresan görüntülerini elde edin.

Gerilme sonrası hücre görüntülerinde, gerilme görüntüleri için açıklandığı gibi, gerilme uygulaması öncesi, sırası ve sonrasındaki hücrelerin ve floresan işaretli çekirdeklerin görüntüleri, normalize edilmiş nükleer gerilmeyi hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde, analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB betiği kullanılmıştır; ancak uygulanan substrat gerilmesini manuel olarak hesaplamak için çeşitli alternatif seçenekler mevcuttur; bu işlem, karşılık gelen gerilme öncesi ve gerilme sonrası görüntüler arasında membran üzerinde yer alan üç ila altı kontrol noktasının konumlarını eşleştirmeyi içerir. MATLAB programı daha sonra, gerilme öncesi ve tam gerilme görüntüleri arasındaki eşleşen kontrol noktalarının konumlarını karşılaştırarak uygulanan membran gerilmesini hesaplar.

Pre-train ve post-strain görüntüler arasındaki artık gerilme için konumlar da karşılaştırılır. Kontrol noktaları, hasarlı veya ayrılan hücrelerin tespit edilmesine yardımcı olmak amacıyla görüntü çiftlerini hizalamak (register) için eş zamanlı olarak kullanılır. Ardından, her bir çekirdek için nükleer gerilmeyi hesaplayan ayrı bir MATLAB programı kullanılarak çekirdekleri manuel olarak seçin.

Bu işlem, karşılık gelen gerilme öncesi ve sonrası floresan görüntüler arasında çekirdek boyutunun eşleştirilmesiyle veya farklı deneyler arasında uygulanan membran gerilmesindeki küçük varyasyonları hesaba katmak için çekirdek içi belirteçlerin eşleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Sonuçlar, normalize edilmiş çekirdek gerilmesi olarak ifade edilir. Bu, her bir çekirdek için hesaplanan, indüklenen çekirdek gerilmesinin uygulanan membran gerilmesine oranı olarak tanımlanır.

MATLAB betikleri, talep üzerine lambing laboratuvarından temin edilebilir. Son bir adım olarak, her bir çekirdek doğrulanır ve gerinim uygulaması sırasında ayrılan veya hasar gören hücrelerden alınan ölçümler kapsam dışı bırakılır. Silikon membran üzerindeki iki farklı alana yayılmış MEF'ler, burada %20UNI eksenel gerinim uygulamasının öncesinde, sırasında ve sonrasında faz kontrastı ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir; bu, gerinim uygulamasına herhangi bir hasar veya ayrılma olmadan dayanan hücrelerin geçerli çekirdeklerini içeren başarılı bir deney örneğidir.

Buna karşılık, burada gösterilen hücreler gerinim uygulaması sırasında büzülmüş veya kısmen ayrılmış olup analiz dışı bırakılmıştır. Sol taraftaki hücre,le sitoskeletal hasar ve nükleer çökme belirtileri gösterirken, sağ taraftaki hücre gerinim uygulaması sırasında kısmen ayrılmakta ve büzülmektedir. Bu durum, aşırı gerinimin bir göstergesi olabilir.

Burada, Lamin AC eksikliği olan farelerin farklı met hücre hatlarından oluşan bir panelde normalize edilmiş nükleer gerinim analizi gösterilmektedir; hücreler, yaban tipu kardeşlerinden gelen met hücreleriyle karşılaştırıldığında, ya boş bir vektörü ya da yaban tipu lamin A'yı ektopik olarak eksprese ederler; nükleer zar proteinlerinin ekspresyon kaybı, normalize edilmiş nükleer gerinimde artışla sonuçlanır. Bu durum, nükleer sertliğin azaldığını göstermektedir ve bu durum yaban tipu Lamin A'nın yeniden tanıtılmasıyla kısmen veya tamamen geri döndürülebilir. Mikroiğne manipülasyon deneyine hazırlanmak için, 35 milimetrelik cam tabanlı bir hücre kültürü kabını düşük konsantrasyonlu fibronectin ile 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından kabı iki kez HBSS ile yıkayın ve kaba iki mililitre büyüme ortamı ekleyin.

Ardından, fare embriyonik fibroblastları %0,05'lik tripsin ile tripsinize edilir ve iki mililitre büyüme ortamı içeren, fibronectin kaplı cam tabanlı kaplara ekilir. Tekil, yapışık ve konfluent olmayan hücreler elde etmek için hücreler gece boyunca inkübatörde bekletilir; hücreleri boyamak için büyüme ortamına MitoTracker mitokondriyal boya ve Hoechst nükleer boya eklenir. Bu büyüme ortamı hücrelere eklenir ve ardından inkübasyon uygulanır.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca Hank dengeli tuz çözeltisinde inkübe ederek yıkayın. Daha sonra, görüntüleme için hücrelere 25 millimolar HEPES içeren fenol kırmızısı içermeyen büyüme besiyeri ekleyin.

Mikro iğne deneyi için, önceden çekilmiş bir mikro iğneyi, dijital şarj bağlı aygıt kameralı ve odaklamalı bir ters mikroskoba bağlı mikro manipülatöre yerleştirin. Mikro iğneyi tek bir hücrenin yakınına odaklayın. Mikro iğne henüz hücre iskeletine yerleştirilmeden önce tek bir hücrenin bir görüntüsünü alın.

Faz kontrastında, kancaların 3 3, 3 4 2 boyamasının bir floresan görüntüsünü ve mitokondriyal boyamanın bir floresan görüntüsünü 60 x objektifli bir ters mikroskop altında alın; mikro manipülatör kullanarak mikro iğneyi, nükleer periferiden sabit bir uzaklıkta olan bir hücrenin sitoplazmasına dikkatlice yerleştirin ve bir faz kontrast görüntüsü, kancaların 3 3, 3 4, 2 boyamasının bir floresan görüntüsü ve mitokondriyal boyamanın bir floresan görüntüsünü alın. Bilgisayar kontrollü mikro manipülatörü kullanarak, her 10 saniyede bir otomatik olarak görüntü alırken, mikro iğneyi saniyede bir mikrometre hızla hücre periferisine doğru belirli bir mesafe kadar hareket ettirin.

Mikroiğne hücre çevresine doğru belirli bir mesafeye hareket ederken, tutarlı bir mikro-manipülasyon gerçekleştirmek için mikro manipülatör bir bilgisayar aracılığıyla kontrol edilmelidir. İşlemler, mikroiğne geri çekildikten sonra görüntülerin alınmasıyla tamamlanır; mikroiğne manipülasyonundan önce, manipülasyon sırasında ve sonrasında elde edilen çekirdek ile hücre iskeletinin floresan işaretli özelliklerine ait görüntüler, küçük hücre içi bölgelerin yer değiştirme miktarını hesaplamak için analiz edilir. Bu gösterimde analiz için özel olarak yazılmış bir MATLAB betiği kullanılmıştır ancak başka çeşitli seçenekler de mevcuttur.

Mikro iğnenin oluşturduğu yer değiştirmeyi ölçmek için kullanılan MATLAB betiği, talep üzerine lambing laboratuvarından temin edilebilir. MATLAB programı, floresan işaretli özelliklerin orijinal konumu ile yeni belirlenen konumları arasındaki kaymayı hesaplamak için normalize edilmiş çapraz korelasyon algoritması kullanır. Yer değiştirmeler daha sonra vektör haritaları olarak görüntülenir ve sayısal değerler olarak kaydedilir.

Bir sonraki adım, elde edilen yer değiştirme vektör haritalarını kullanarak sitoskelet veya çekirdek içindeki ortalama yer değiştirmeleri matlab ile belirlemektir. İlk olarak, gerinim uygulama bölgesindeki sitoskelet içinde üç veya daha fazla nokta seçin. Yer değiştirme vektör haritasında, mikro iğne uygulaması sırasında uygulama bölgesinin yakınında oluşan sitoskeletal gerinim miktarını belirlemek için ortalama sayısal değeri alın.

Ardından, çekirdek içinde, gerilimin uygulandığı bölgeye yakın üç veya daha fazla nokta seçin ve ortalama değeri alın. Bu değer, mikro-iğne uygulama bölgesinin yakınındaki nükleer gerilimin miktarını temsil eder. Aynı yöntemi kullanarak, ilgili bölgelerden seçilen noktalardan yararlanarak gerilimin uygulandığı bölgeden uzaktaki nükleer ve hücre iskeleti gerilimini belirleyin.

Hücre içi kuvvet iletimini ölçmek için bir mikroiğne manipülasyon deneyi gerçekleştirilmiştir. Burada, mavi çekirdek boyası ve MIT tracker green mitokondriyal boyası ile işaretlenmiş bir fibroblastın faz kontrast ve floresan görüntüleri gösterilmektedir. Bir mikroiğne, çekirdekten belirli bir uzaklıkta hücre iskeletine yerleştirilmiş ve ardından hücre çevresine doğru hareket ettirilmiştir.

Mitokondriyal yer değiştirme, sitoskeletal gerilme öncesinde, sırasında ve sonrasında takip edilmiş ve ardından yer değiştirmeler vektörler olarak grafiğe dökülmüştür. Her vektör, orijinal konum ile yeni belirlenen konum arasındaki kayma olarak hesaplanan yer değiştirmeyi temsil eder. Düşük görüntü yoğunluğuna sahip veya dokusu yetersiz olan bölgeler analiz dışında tutulmuştur.

Ardından, hem kontrol fibroblastları hem de fibroblastlar için, gerilme uygulama noktasından artan uzaklıktaki seçili alanlardale sitoskeletal ve nükleer yer değiştirmeler nicelleştirilmiştir. Nükleo-sitoskeletal bağlantısı sağlam olan hücrelerde kuvvetler tüm hücre boyunca iletilir; bu durum, gerilme uygulama noktasından uzaklaştıkça yavaşça azalan indüklenmiş nükleer ve sitoskeletal deformasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, nükleo-sitoskeletal bağlantısı bozulmuş olan hücreler, uygulama noktasının yakınında lokalize yer değiştirme ve daha uzak bölgelerde ise sadece çok az indüklenmiş deformasyon gösterir.

Hem kontrol fibroblastları hem de çekirdek-iskelet bağlantısı bozulmuş fibroblastlar için mikroiğne giriş noktasında benzer sitoskeletal gerinim uygulaması gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, diğer bölgelerde indüklenen nükleer ve sitoskeletal yer değiştirme, çekirdek-iskelet bağlantısı bozulmuş fibroblastlarda kontrol hücrelerine göre anlamlı düzeyde daha düşük çıkmıştır. Bu nedenle, gerinim uygulama noktasından uzaklaştıkça sitoskeletal ve nükleer yer değiştirmenin azalması, sitoskelet ve çekirdek arasındaki zorunlu iletimin bozulduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, nükleer mekaniğin ve çekirdek ile hücre iskeleti arasındaki hücre içi kuvvet iletiminin nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmanız gerekir. Bu teknikleri, nükleer zar proteinlerindeki mutasyonların etkilerini veya gelişim sırasında ya da kanserde meydana gelen nükleer zar bileşimindeki değişiklikleri incelemek için kullanabilirsiniz.