Microtiter Plate Format Broth Seyreltme Birinci ve İkinci Line İlaçları Mycobacterium tuberculosis kompleksi Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Mycobacterium tuberculosis tedavisi için mevcut ilaç sayısı nispeten azdır, bu nedenle herhangi bir ilaca karşı gelişen direnç endişe vericidir. Bu video makalesi, M tuberculosis'in 12 farklı mikrobiyolojik ilaca karşı antibiyotik direncini aynı anda test etmeye yönelik bir prosedürü tanımlamaktadır. Dolayısıyla, M tuberculosis'in antimikrobiyal direncini hızla tespit edebilme yeteneği, dirençli suşların artışını kontrol altına alma çabalarında oldukça önemlidir; burada antibiyotik duyarlılığı test edilmektedir.

M tuberculosis önce katı ortamda veya sıvı besiyerinde, bir bakteriyel süspansiyon şeklinde büyütülür. İnokülum hazırlanır ve inkübasyon sonrası, birinci basamak ve ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere 12 farklı ilacın farklı konsantrasyonlarını içeren bir mikrotitre plağına eklenir. Her kuyucuktaki büyüme miktarı, ya bir ayna kutusu kullanılarak manuel olarak ya da yarı otomatik bir plaka okuyucu kullanılarak belirlenir.

Elde edilen veriler, test edilen her bir ilaç için minimum inhibitör konsantrasyonunu belirtir ve test edilen TB suşunun hangi antibiyotiklere dirençli olduğunu gösterir. Bu sonuçlar, tb tedavisi için uygun ilacın seçilmesine yardımcı olur. Merhaba, benim adım Nancy Ek; Minnesota, Rochester'daki Mayo Clinic Myco Bakteriyoloji Laboratuvarı'nın direktörüyüm.

Bugün, mycobacterium tuberculosis için antibiyotik duyarlılık testi gerçekleştirme yöntemini açıklayacağız. Bu tekniğin, makro besiyeri dilüsyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, her ilaç için bir MIC değerinin belirlenmesi ve 12 antibiyotiğin eş zamanlı olarak test edilebilmesidir. Prosedür, laboratuvarımdaki kalite uzmanı Kurt Jude tarafından laboratuvar tezgahında gösterilecektir.

Bir kanlı agar plak, üç Middlebrooks 7H10 plak, bir salin tween cam boncuklu tüp ve bir mikrotitrasyon plağını hastanın adı ve numune tanımlama numarasıyla etiketleyerek bu prosedür için hazırlık yapın. Ek olarak, kanlı agar ve 7H10 plaklarını "saflık" (purity) olarak etiketleyin. Bu 7H10 plaklarından birini "1'e 1 koloni sayımı", diğerini ise "1'e 50 koloni sayımı" olarak işaretleyin.

Ardından tepsiyi geçiş bölmesine yerleştirin. Daha sonra; önü kapalı önlük, baş kılıfı, eldiven, galoş ve solunum cihazı giyerek seviye üç biyogüvenlik BSL üç tesisinde çalışmaya hazırlanın. Burada, bir PAPA solunum cihazı kullanılır.

Ardından tepsiyi geçiş penceresinden geri alın. Sonra, BSL 3 tesisinde, biyogüvenlik kabininin yüzeyini dezenfekte edin. Daha sonra, havlu kağıdı dezenfektanla ıslatıp, hava tahliye paneline yaklaşık altı inç mesafede olacak şekilde kabinin içine yerleştirin.

İnokülasyon öze döngüleri, pipetleyiciler ve uçlar, uygun bir atık imha kabı, bir nephi, TER ve bir vorteks yerleştirin. Davlumbaz hazırlandığında, organizmayı, McFarland 0.5 standardı, OADC içeren bir seven H nine besiyeri ve bir salin boncuk tüpü bulunan bir raf ile birlikte kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Bu kurulum katı besiyerinden gerçekleştirilir.

Bir hastadan alınan örnekten, katı besiyeri kültüründen inokülüm hazırlayın. Kolonileri kazımak için steril bir öze kullanın ve bunları salin tween cam boncuklu tüpe aktarın. Süspansiyonu 30 ila 60 saniye boyunca vorteksleyin.

Numuneyi, McFarland standardı ile karşılaştırarak görsel olarak inceleyin. Aktarılan miktar, standartla eşit veya standarttan daha fazla olmalıdır. Eğer değilse, daha fazla bakteriyel numune ekleyin ve tekrar vorteksleyin.

McFarland standardı ile eşleşme sağlandıktan sonra, bakterilerin daha büyük kümelerinin çökmesine izin vermek için inokülümü 15 dakika boyunca bekletin. Ardından, süspansiyon halindeki bakterilerin yoğunluğunu sıfırlamak için bir nephi meter kullanın. Nephi meter.

Önce neprofometreye boş bir salin boncuklu tüp yerleştirin. Cihazı sıfırlamak için kalibre düğmesine basın, ardından McFarland 0.5 standardını neprofometreye yerleştirin ve kalibre düğmesine tekrar basın. Cihaz kalibre edildikten sonra McFarland standardını çıkarın ve inokülumu yerleştirin.

İnokülüm okuması McFarland standart okumasına eşit olmalıdır. Okuma çok düşükse, tüpü çıkarın ve plakadan daha fazla bakteri aktarın. Ardından vorteksleyin ve örneği tekrar okuyun.

Okuma değeri çok yüksekse, tüpe saline tween ekleyip vorteksleyin. Ardından örneği tekrar okuyun. Bakteri konsantrasyonu McFarland standardı ile eşleşene kadar inokülumu gerektiği gibi ayarlamaya devam edin.

Ardından, tüpün üst üçte birlik kısmından 100 µL inokülumu almak için 200 µL'lik bir pipet ve uzun, aerosolle dirençli bir pipet ucu kullanın. Tabana çöken topaklanmaları önlemek için Middlebrook 7H9 besiyerini inoküle edin; inokülumu ekim plakasına aktarmadan önce inoküle edilmiş besiyerini 20 saniye boyunca yavaşça vorteksleyin. İlk olarak mikrotitre plağını üretici paketinden çıkarın. Eğer kurutucu mavi renkteyse veya folyo paket hasarlıysa, plağı kullanmayın.

Plaka, her bir kuyucukta test edilecek, en etkili veya birinci basamak ilaçlar ile ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere 12 antimikrobiyal maddeyi halihazırda içermektedir. Aerosol oluşmamasına dikkat ederek, yedi H dokuz besiyeri inokülümünü dikkatli bir şekilde bir tüpe boşaltın. Ardından, mikro titrasyon plakasını burada gösterildiği gibi etiketi dışa bakacak şekilde yerleştirin ve her bir kuyucuğa 100 µL inokülüm eklemek için 12 kanallı bir pipet kullanın.

Ardından, koloni sayımlarını gerçekleştirmek için plakları hazırlayın. İlk olarak, pozitif kontrol kuyucuğundan bir mikrolitre loop ile numune alıp bire bir etiketlenmiş seven H 10 plağına aktararak seyreltilmemiş bir plak hazırlayın. Daha sonra, plağı burada gösterildiği gibi ekim yapmak için loop'u kullanın.

Ardından, 1/50'lik bir dilüsyon hazırlamak için, pozitif kontrol kuyucuğundan bir mikrolitre loop ile örnek alın ve 50 µL su içeren tüpün içine aktarıp karıştırın. Bu dilüsyondan 1 µL'yi 1/50 olarak etiketlenmiş plak üzerine ekin. BKT'den 50 µL inokülümü uygun şekilde etiketlenmiş kan agarı ve 7H10 plaklarına pipetleyerek ekim yapın ve izolasyon için çizgi ekimlemesini gerçekleştirin.

Ardından, eklemeli trth'nin üzerine bir başka trth daha yerleştirin ve bunları nazikçe atık konteynerine koyun. Mikrotitrasyon plağının üzerine yapışkanlı bir sızdırmazlık bandı yerleştirin. Daha sonra, beyaz destekleyiciyi kullanarak, kırışıklık kalmadığından emin bir şekilde, yeterli sızdırmazlığı sağlamak için her bir kuyucuğa sıkıca bastırın.

Mikrotitrasyon plağını, tüberkülozisid bir dezenfektanla ıslatılmış kâğıt havlu ile silerek dezenfekte edin. Ardından mikrotitrasyon plağını plastik bir torbaya yerleştirin ve ısı ile mühürleyerek kapatın. Son olarak, nephi, lter vortex, plaklar ve tüpler dahil tüm malzemeleri tüberkülozisid bir dezenfektanla silerek dezenfekte edin.

Burada, dezenfeksiyonun sağlandığından emin olmak için yeterli süre geçtikten sonra pro spray kullanılır. Pro spray için 15 dakika beklenir. Plakalar scotch bantla bantlanıp plastik torbalara yerleştirilir ve mühürlenmiş malzemeler biyogüvenlik kabininden çıkarılarak geçiş kutusuna (pass through) yerleştirilir.

Atık kırmızı torba bu noktada kapatılır ve bir bükme bağla mühürlenir; önlük, galoşlar ve eldivenler çıkarılır. Ön odaya geçilip eller yıkandıktan sonra respiratör çıkarılır, tekrar el yıkama işleminin ardından dezenfekte edilerek saklanır, yeni bir önlük giyilir ve BSL 3 süitinden çıkılır. Ardından, atık konteyneri otoklavlanır.

Ardından, mikrotitre plakasını ve yedi adet H 10 ve kan auger plakalarını, BSL 2 laboratuvarındaki 35 ila 37 °C sıcaklıktaki ve %5 ila %10 CO2 içeren inkübatöre ağızları yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Plakanın sıkıca mühürlenmiş ve plastik bir torba içinde olması nedeniyle bu işlem uygundur. Mycobacterium tuberculosis nesil süresi yaklaşık 12 ila 24 saattir, bu nedenle kontrol kuyusunun dibinde bir hücre peletinin oluşumu şeklinde büyüme görülene kadar en az bir hafta geçeceği öngörülür. 10. günde, mühürlenmiş AST mikrotitre plakasını aynalı kutunun platformuna yerleştirerek manuel ayna okuması gerçekleştirin.

Büyümeyi görselleştirmeye yardımcı olması için bir masa lambası kullanın ve en iyi kontrastı elde etmek için gerektiğinde ayarlama yapın. Aynaya bakarak, bu durumdaki büyüme kontrol kuyucuklarını, yani H 11 ve H 12'yi kontrol edin. Eğer büyüme varsa, kuyucuk burada gösterildiği gibi bulanık görünecek veya tortu varmış gibi görünecektir.

Bu örnekte gösterildiği gibi büyüme yoksa, kuyu berrak görünecektir. Bu durumda, plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve inkübasyona 21 güne kadar devam edin. Her bir koşul için büyümeyi kontrol grubuyla karşılaştırın.

Ardından, her bir ilaç kaydı için, büyüme görülmeyen ilk dilüsyon belirlenir. Bu, ilaç için minimum inhibitör konsantrasyon veya MIC değeridir. Vision gibi otomatik bir plaka okuyucu kullanarak sonuçları incelemek için, önce Myco TB a ST plaka yazılımını açarak oturum açma işlemiyle başlayın; ardından mühürlü plakayı, barkodu dışarıya bakacak şekilde yerleştirin. Burada gösterildiği gibi, büyüme, bilgisayar ekranında bir kuyucuğun dibinde bulanıklık veya hücre çökelmesi şeklinde görülür.

Öncelikle, büyüme kontrollerini inceleyin. Daha önce olduğu gibi. Eğer büyüme negatifse, plağı 21 güne kadar inkübatöre geri yerleştirin.

Eğer sonuç pozitifse, her bir ilaç için ekranda büyüme göstermeyen ilk kuyucuğa dokunarak sonuçları kaydedin. Bazı durumlarda bakteriler, tortular veya ilaçlar kuyucuğun dibine çöker. "Trailing" (iz sürme) olarak bilinen bu fenomen, aynı boyutta pelet içeren birkaç kuyucuğun varlığı ile kendini belli eder ve aslında pozitif büyüme olarak değerlendirilmez.

Ardından, bakteriyel konsantrasyonların belirlenmesi ve saflığın değerlendirilmesi amacıyla yedi H 10 ve kanlı agar plakları incelenir. Kanlı agar plağında 48 saat sonra üreme görülmemelidir. Kanlı agar plağındaki üreme, hızlı büyüyen bakterilerle kontaminasyon olduğunu gösterir.

Eğer üreme varsa, mikrotitre testi tekrarlanmalıdır. Yedi H 10 saflık plağında tek bir organizmanın üremesi gerekir. Tip EM tuberculosis; bej renkli, kırışık ve pürüzlü görünmelidir. Kontaminasyon mevcutsa, Mikrotitre testinin saf bir kültürden tekrarlanması gerekir.

Bakteriyel konsantrasyonu değerlendirmek için yedi H 10 plakasındaki kolonileri sayın. Ardından, beraberindeki yazılı belgede yer alan tabloyu kullanarak koloni sayılarını hesaplayın. Bir hasta örneğinden Mycobacterium tuberculosis üretilmiş ve antibiyotik direnci bu videoda açıklandığı şekilde değerlendirilmiştir; burada gösterilen plakada, en yüksek konsantrasyonlar üstte ve en düşük konsantrasyonlar altta olacak şekilde, artan konsantrasyonlarda 12 farklı ilaç bulunmaktadır.

İlacın minimum inhibitör konsantrasyonu veya MIC'si, herhangi bir üreme göstermeyen en düşük ilaç konsantrasyonu ile belirlenmiş olup, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü tarafından belirlenen standart kırılma noktaları kullanılarak burada gösterilen görüntüde daire içine alınmıştır. Burada sunulan veriler, bu TB suşunun Isid ve Rifampin'e karşı dirençli olacağını göstermektedir. İn vitro ortamda, oin, moxifloxacin, streptomycin ve rifabutin dahil olmak üzere diğer birçok ilaçta görülen yüksek MIC değerleri, EM tüberküloz suşunun bu ajanlara karşı dirençli olduğunu göstermektedir.

MIC sonuçları, tüberküloz tedavisi konusunda deneyimli bir enfeksiyon hastalıkları uzmanı tarafından kişiselleştirilmiş bir tedavi planı oluşturmak için kullanılmalıdır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, tek bir izolatın kurulumu yaklaşık 40 dakika sürer. Bu prosedürü uygularken, bunun bir solunum yolu patojeni olduğunu ve aerosol oluşturma riskinin bulunduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, mikro broth dilüsyon yöntemi kullanılarak mycobacterium tuberculosis antimikrobiyal duyarlılık testinin nasıl kurulacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Mycobacterium tuberculosis ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve gerektiğinde solunum koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.