Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, inhibitör nöronal devrelerin yerel fonksiyonel organizasyonunu incelemektir. Prosedür, farelerin primer somatosensör korteksinden canlı beyin kesitlerinin hazırlanmasıyla başlar. Bir sonraki adım, beyin kesitindeki hedeflenen GFP eksprese eden inhibitör hücre tiplerini görselleştirmek ve bunlardan kayıt almaktır.

Glutamat aracılığıyla gerçekleştirilen bu lazer tarama fotoestimülasyonunun ardından, presinaptik nöronların küçük kümelerini eksitatör veya inhibitör olarak aktive etmek için kafes açma (uncaging) yöntemi kullanılır. Postsinaptik akımlar, GFP eksprese eden inter nöronlarda kaydedilir. Son adım, fotoestimülasyon ve veri analizini gerçekleştirerek kaydedilen nöronlara gelen sinaptik girdilerin kantitatif haritalarını oluşturmaktır.

Nihayetinde, lazer taramalı foto-stimülasyonun tüm hücre kayıtlarıyla birleştirilmesi, spesifik inhibitör nöron türlerine gelen sinaptik girdilerin detaylı haritalarının oluşturulmasına olanak tanır; bu da yerel inhibitör kortikal devrelerin organizasyonunun ve fonksiyonunun belirlenmesini sağlayabilir. Foto-stimülasyona dayalı bu teknik Dr. Larry Katz ve Ned Calloway tarafından öncülük edilmiş ve ardından pi'm Dr. Carols Waboda ile Dr. Calloway ile Salk Enstitüsü'nde eğitim alan ve burada interoral devreleri araştıran birçok çalışmaya liderlik eden Dr. Xing Z tarafından geliştirilmiştir. Grubumuz şu anda interoral devreleri araştırarak bu çalışmaları genişletmekte ve sürdürmektedir.

Bu prosedüre başlamak için, doğum sonrası ikinci veya üçüncü haftadaki transgenik bir fareyidekapitasyon yoluyla sakrifiye edin ve beyni hızla çıkarıp dondurulmuş ve oksijenlendirilmiş bir kesme solüsyonuna yerleştirin. Ardından, GFP ekspresyonunu görsel olarak taramak ve kontrol etmek için GFP gözlüklerini kullanın. Sonrasında, primer somatosensoriyel korteksi bir vibratom ile 400 µm kalınlığında kesitlere ayırın.

Kesitleri, %95 O2 ve %5 CO2 ile havalandırılmış, sükroz içeren A CSF içerisinde 32 degrees Celsius'de 30 dakika ile bir saat arası inkübe edin. Ardından, lazeri deney için hazırlamak amacıyla kesitleri oda sıcaklığındaki standart A CSF'ye aktarın; lazer soğutma sistemini ve güç kaynağını açın. Sonra, tarama aynası sistemi, optik modülatör, elektronik perde ve bir fotodiyot giriş amplifikatörü dahil olmak üzere foto stimülasyon kontrolü ile ilgili tüm donanımları çalıştırın.

Ardından, multi clamp 700 B amplifikatör ve mikromanipülatörler gibi elektrofizyolojik ekipmanları açın. Elektrofizyolojik kayıtlar, foto stimülasyon ve görüntüleme, mikroskobun motorlu tablasına monte edilmiş olan dilim perfüzyon odasında gerçekleştirilir. Sonrasında görüntüleme kamerasını açın; dilim, görüntüleme sistemi aracılığıyla dik mikroskopta kızılötesi DIC ve epi floresan optikler ile görselleştirilecektir.

Ardından, monitörde MATLAB tabanlı FS yazılımını ve Q capture kamera yazılımını açın. Deneyi başlatmadan önce, lazer foto stimülasyon sistemini kontrol edin ve çalışır durumda olduğundan emin olun. Sistem çalışırken lazer tarama desenini gözlemlemek için 4x mikroskop objektifinin altına bir parça kağıt yerleştirin.

Dört ila altı mega ohm dirence sahip mikro elektrodu hazırlamak için, pipet çekici ile bir cam elektrot çekin. Ardından elektrodu, hücre etiketleme ve morfolojik tanımlama için %0,1 biotin içeren bir iç solüsyonla doldurun. Daha sonra, CSF'yi kamraya pompalamak için basınçlı perfüzyon sistemini çalıştırın.

Haznedeki kesitin üzerinde 2.0 milimetre sabit sıvı seviyesi sağladığınızdan emin olun. 0.2 milimolar kafeslenmiş glutamat konsantrasyonu elde etmek için, dolaşımdaki 25 mililitre A CSF'ye MNI kafeslenmiş glutamat stok çözeltisinden bir alikot ekleyin. Ardından, bir beyin kesitini kayıt haznesine aktarın.

Kesit kalitesini kontrol etmek ve primer somatosensoriyel alanı anatomik olarak belirlemek için görüntüleme sistemini çalıştırın. Ardından, kesiti özel yapım ipli bir platin halka ile sabitleyin ve sabitleyicinin kayıt yapılması planlanan beyin bölgesinin üzerine gelmemesine dikkat edin. GFP ekspresyonunun bir DIC floresan mikroskobu altında görüntülenmesi yoluyla hücreleri 60 x objektif ile görselleştirin.

İnhibitör hücre tiplerini tanımlayın ve seçin. Lütfen kayıt işleminin, kızılötesi DIC yardımıyla görsel kontrol altında gerçekleştirileceğini unutmayın. Elektrot hedef hücreye indirilirken GFP'li hücrenin konumunu doğrulamak için video izleme ve DIC ile floresan modları arasında geçiş yapılması gereklidir.

Konvansiyonel patch clamp tekniği kullanılarak. İlk olarak, elektroda pozitif basınç uygulayın. Hedef hücre membranında belirgin bir çöküntü oluşturmak için elektrodu hücre yüzeyine yaklaştırın.

Ardından, video monitöründen akım enjeksiyon yanıtlarını izlerken, giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturmak ve hücreye girmek için hızla negatif basınç uygulayın. Hücreye giriş yapıldığında, çevrimiçi doğrulama için DIC ve floresan modlarında, 60 x büyütmede GFP ekspresyonu gösteren intra nöronun görüntülerini alın. Fotostimülasyon verilerini toplamadan önce, her bir hücrenin temel elektrofizyolojik özelliklerini incelemek için hiperpolarizan ve depolarizan akım darbeleri enjekte edin.

Erişim direncinin genellikle 20 mega ohm'un altında olduğu, iyi bir erişim direnciyle stabil tüm hücre kaydı sağlandığında, lazer taramalı fotostimülasyon için mikroskop objektifini 60x büyütmeden 4x büyütmeye getirin; 4x büyütmede bir kesit görüntüsü alın ve bunu fotostimülasyon bölgelerini belirlemek ve kaydetmek için kullanın. phys'in konfigürasyon anahtar modülünü etkinleştirerek fotostimülasyon ve veri toplama parametrelerini ayarlayın. Bir saniyelik uyarı aralığıyla, yaklaşık 20 miliwatt gücünde bir milisaniyelik lazer darbesi kullanın.

Fotoestimülasyon haritalaması için, 10 kilohertz örnekleme hızıyla bir saniyelik veri izleri elde edin. Ardından, dört x kesit görüntüsünü phys'in haritalama modülüne yükleyin. Soma konumunu belirleyin ve 80 mikrometreye 80 mikrometre boyutlarında, 16'ya 16 düzeninde fotoestimülasyon noktalarını ayarlayın.

Tüm kortikal katmanları kapsayan hücre konumunun etrafındaki boşluklar belirlenir. Ardından, akım klembi modunda fotostimülasyona yanıt olarak ortaya çıkan spike konumlarını inceleyerek, kaydedilen nöronun eksitasyon profili haritalandırılır. Çevrimiçi görüntüleme özelliklerine sahip kullanıcı dostu yazılımımız, haritalama deneylerini kolaylaştırır.

Ardından, kayıt alınan hücreden eksitatör post-sinaptik akımları tespit ederek yerel eksitatör devre bağlantılarını haritalandırın. Farklı konumlarda lazer tarama yaparken, içeriye doğru eksitatör akımları tespit etmek için hücreyi voltaj klemp modunda negatif 70 millivolt'ta tutun. Daha sonra, foto stimülasyon paterni döndürülmüş veya ters çevrilmiş şekilde eksitatör post-sinaptik akım haritalama işlemini iki ila üç kez tekrarlayın. Yerel inhibitör devre bağlantılarını haritalandırmak için kayıt alınan hücreden inhibitör post-sinaptik akımları tespit edin.

Dışa dönük inhibitör akımları tespit etmek için bu durumda hücreyi sıfıra yakın milivolt değerinde, voltaj klembi modunda negatif 15 milivolt değerinde tutun. Tüm fizyolojik analizleri tamamladıktan sonra, elektrodu kaydedilen hücreden nazikçe çıkarın. Beyin kesitini kamaradan çıkarın, ardından gece boyunca %4 paraformaldehitte sabitleyin ve kaydedilen hücreleri biyotine karşı boyayın.

Bu deneyde, inhibitör nöronları sınıflandırmak için GFP ekspresyonu, intrinsik elektrofizyoloji ve morfolojik özelliklerin kombinasyonu kullanılmıştır. Gösterildi. Burada, kaydedilen inhibitör nörona yönelik yerel kortikal devre bağlantılarının kapsamlı haritalanmasına olanak tanıran lazer taramalı foto stimülasyonu örneklendirmek için bir örnek ve bir ham veri haritası yer almaktadır. Burada, Şekil D'de az önce gösterilen ham izlerden türetilen renk kodlu kantitatif girdi haritalarının örnekleri bulunmaktadır. Kaydedilen inter nöronlarda tespit edilen sinaptik olayların amplitütleri renklerle kodlanmış ve foto stimülasyon konumlarının üzerine topografik olarak bindirilmiştir.

Hücre gövdesinin konumu, ölçek çubuğundaki kırmızı açık daire ile belirtilmiştir. Sıcak renkler güçlü sinaptik girdileri, soğuk renkler ise hedeflenen hücreye yönelik zayıf bağlantısallığı veya bağlantısallığın olmadığını göstermektedir. Benzer şekilde, şekil E, kaydedilen nörona yönelik örneklenen her bir kafes açma (uncaging) konumu başına düşen sinaptik olay sayısını sunmaktadır.

Şekil F, ölçek çubuğuna göre fotoestimülasyon sonrası kaydedilen hücrede tespit edilen ilk sinaptik olayın başlangıç süresini göstermektedir. Sıcak renkler kısa girdi gecikmesini, daha soğuk renkler ise daha uzun sinaptik gecikmeleri belirtmektedir. Böylece LSPS, spesifik inhibitör nöron türlerine gelen girdilerin konumunun, gücünün, gecikmesinin ve sayısının ayrıntılı haritalarının oluşturulmasına olanak tanır.

Bu prosedürü uygularken sabırlı olmak, temiz deney koşulları sağlamak ve nöronları yüksek büyütmeli objektiften düşük büyütmeli objektife etkili ve çok dikkatli bir şekilde geçirmek önemlidir. Ardından, analiz yazılımını yetkin bir şekilde kullanın.