Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mikro ve nano ölçekli boyutlarda gerçekleşen bireysel ve grup hücre davranışlarıyla ilgili biyolojik soruları incelemek için hücre mikroortamları oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle hücre yerleşimine rehberlik edecek şablonların tasarlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bu tasarımlar fotolitografi yoluyla desenli yüzeylere aktarılır; bu süreç, yumuşak litografi aracılığıyla plazma kalkanlama kalıplarının oluşturulmasına olanak tanır.

Son olarak, bu koruma kalıpları, alttaki yüzeylerin plazmaya seçici olarak maruz kalmasını sağlamak için bir Petri kabında tripod şeklinde düzenlenir; bu işlem, her kalıbın altındaki alanlarda hücreye duyarlı bir kimyasal desen bırakacaktır. Bir hücrenin davranışının mikroçevresine ve komşu hücrelerle olan etkileşimine nasıl bağlı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, mikroçevrelerin hücre davranışı üzerindeki etkileriyle ilgili, örneğin hücre grupları arasındaki etkileşimlerin üst düzey fenomenleri nasıl etkilediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Peki, hücresel alt düzeydeki nan ölçekli ipuçları, sağlıklı göç ve farklılaşma gibi işlevleri nasıl etkiler? İlk olarak, desenli bir lamı boş lam yığınındaki yerine sabitlemek için hızlı yapıştırıcı kullanın. Ardından, lam yığınından biraz daha büyük ve 30 gram polidimetilsiloksan veya PDMS tutabilecek büyüklükte alüminyum folyodan bir kap oluşturun.

Lam yığınını konteynere yerleştirin ve başlangıç kalıbını oluşturmak için lam yığınının üzerine PDMS dökün. Ardından, konteyneri bir vakum odasına yerleştirerek PDMS'teki gazları giderin. Havanın kısa süreliğine odaya girmesine izin vermek için emiş valfi borusunun üzerindeki parmağınızı birkaç kez hızlıca kaldırıp tekrar yerleştirerek PDMS içinde bulunan tüm kabarcıkları patlatın.

Kesintisiz gaz giderme işlemi için valf beş dakika boyunca kapalı tutulur. Ardından PDMS'in temiz hava akımlı kabinde, oda sıcaklığında bir ila iki gün boyunca kürlenmesi beklenir. Kürlenme tamamlandıktan sonra, PDMS ana kalıptan soyularak bir kalıp oluşturulur.

Ardından, bir dakika boyunca karıştırılmış altı gramlık iki bileşenli epoksiyi ana kalıba ince bir tabaka halinde dökün. Epoksi donmadan önce, çok sayıda kabarcık giderme döngüsü kullanarak epoksiyi hemen vakumlayın. Vakumlanan epoksi bir saat boyunca rahatsız edilmeden bekletildikten sonra kısmen kürlenmiş olacaktır.

Sonraki adımlarda işlemesi daha kolay olan daha kalın bir yapı elde etmek için, vakumlamadan kalıba daha fazla epoksi ekleyin. Ardından epoksinin bir ila iki gün boyunca kürlenmesine izin verin. Epoksi kalıp kürlendikten sonra, epoksiyi PDMS ana kalıptan çıkarın ve ardından bir hazne oluşturmak için epoksi kalıbın etrafını bantla sarın.

Ardından, PDMS'yi epoksi kalıbın üzerine dökerek, PDMS'yi vakumlayarak ve yeni kalıbı bir ila iki gün boyunca kürleyerek bir çalışma kalıbı oluşturulabilir. Çalışma kalıbı kürlendikten sonra, kalıbı epoksiden soyun ve temizliği korumak için her ikisini de petri kapları içerisinde, laminar akış kabini içindeki sızdırmaz bir plastik kapta saklayın. Yüzey desenlemesi için bir kalıp hazırlamak için, çalışma kalıbından jiletle küçük kesitler kesin ve bu kesitleri bir petri kabına yerleştirin.

Bu kalıp kesitlerinin konumları, kalıp kesitlerinin bulunduğu yerin çevresine bir çerçeve çizilerek Petri kabının arka yüzüne kalıcı bir kalemle işaretlenir; kesitlerden bir tripod oluşturulur ve çalışma kalıbı ile Petri kabı yüzeyi arasında konformel temasın sağlanması için tripodu bekleyin. Çıplak gözle veya küçük bir büyüteçle görülebilen kanalların varlığıyla kanıtlanan doğru yerleşimi onaylamak için kabın altına bakın. Düzenek plazma haznesine yerleştirilir.

Plazma işlemi sonrası plazma işlemini başlatın. Kalıbı ve ağırlık düzenini çıkarın ve sterilizasyon için Petri kabını bir biyogüvenlik kabini içinde UV ışığı altında 10 dakika boyunca bekletin. Hücreler ekilene kadar kabı orada saklayın.

İstenen konfluens düzeyini elde etmek için seçilen deneysel hücreleri standart kültür ortamlarında dilüe edin. Desenli Petri kabı yüzeyine yerleştirildiğinde, hücre solüsyonunun üç mililitresini Petri kabına dökün. Hücrelerin plazma hücresi tarafından oluşturulan desen üzerinde toplanmasını sağlamak için desenli Petri kabını 37 °C, %5 karbondioksit ve %100 nem koşullarında birkaç saatten birkaç güne kadar inkübe edin.

Desenleme, faz kontrast mikroskobu ile kontrol edilir. Nöroblastoma hücrelerini kültüre ederken, hücrelerin nörona benzer bir duruma diferansiyasyonu gözlemlenene kadar günlük 10 micromolar retinoik asit ekleyin. Standart hücre kültürü medyumunu her üç ila dört günde bir yenileyin.

Plazma litografisi tekniğinin uygulanmasının tipik bir sonucu, rastgele veya doğal bir yapıyı andıran bir hücre deseninin oluşmasıdır. Bunun bir örneği, çizgisel bir desen üzerinde retinoik asit ile farklılaştırılmış nöronların yer aldığı bu şekilde görülebilir. Çizgilerin ve nöron ağlarının oluşturulduğu bu şekilde olduğu gibi, sonraki iki şekilde görüldüğü üzere nöronlar dışındaki hücre tipleri de kullanılabilir; bu şekil insan göbek bağı ven endotel hücrelerini, bu şekil ise burada görüldüğü gibi ızgaralar oluşturan C2C12 iskelet kas hücrelerini göstermektedir.

Polilizin gibi materyaller, belirli hücre tiplerinin tutunmasını kolaylaştırmak ve diğer kullanım amaçları için desenlendirilerek uygulanabilir. Bu prosedürün ardından, uyaran kombinasyonlarının hücrelerin bireysel davranışlarını ve yüksek mertebeli davranışlarını nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mikroakışkanlar, hücre sondalaması veya belirli proteinlerin genetik manipülasyonu gibi ek girdilerin entegrasyonu gerçekleştirilebilir.