Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Aşağıdaki deneyin genel amacı, konakçı-patojen etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için optik tuzaklamayı döner disk konfokal mikroskopi ile birlikte kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen patojenlerin bölmeli bir lamel üzerine eklenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bir partikül seçilir ve optik tuzakla yakalanır.

Son olarak, partikül ilgili hücreye yönlendirilir. Burada görüldüğü gibi. Optik tuzaklama, dinamik hücre içi etkileşimlerin gözlemlenmesi amacıyla iki partikülün kontrol edilmesi için etkili bir yöntem olabilir.

Bu yöntem, konak hücreler ve patojenler arasındaki uzaysal ilişkilerin tam kontrolü sağlandığında fagositoz üzerindeki etkilerin neler olduğu ve patojenlerin bir fagositik hücre tarafından alınma sırasının fagozomal olgunlaşmayı etkileyip etkilemediği dahil olmak üzere, enfeksiyöz hastalıklar ve immünoloji alanlarındaki konak-patojen etkileşimlerine dair önemli soruları yanıtlayabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tutma koşullarının farklı hücre ve boncuk türleri için optimize edilmesi gerektiğinden zorluk yaşayacaklardır. Dönen disk kurulumu ve entegrasyonu süreci nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Optik bir tuzak ile konfokal sistemin kurulumunu kavramak, tüm optik bileşenler için gerekli olan hassas hizalama nedeniyle zordur. İlgili patojeni toplayın. Örneğin burada, besiyerinde gece boyunca büyütülmüş 300 µL Canada albicans kültürden alınır ve patojenler 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarılır.

Ardından patojenleri oda sıcaklığında yaklaşık 1300 Gs'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın; her seferinde süpernatantı aspire edin ve peleti yeniden süspanse edilmiş PBS ile rahatsız etmeden bırakıp sonikasyon uygulayın. Üçüncü yıkamadan sonra peleti 500 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Sonraki aşamada, 10 mg/mL son konsantrasyon elde etmek için 1 mg dye of entrust'ı 100 µL dimetilformamid içinde çözün.

Ardından, yıkanmış patojenleri içeren reaksiyon tüpüne üç µL boya karışımı ekleyin. Boyalar ışığa duyarlı olduğundan tüplerin etrafını folyo ile sarın ve örneği 37 °C'de bir saat boyunca çalkalayın; ardından örneği daha önce olduğu gibi PBS ile 3 kez çöktürüp yıkayın. Son yıkamadan sonra pellet'i 300 µL PBS içinde yeniden süspande edin.

Sıcak medya tripsini ve PVS'yi bir benmari banyosunda 37 °C'ye ısıtın. RAW 264.7 makrofajlarının bulunduğu 10 santimetrelik doku kültürü plağını, her yıkama arasında PBS'yi aspire ederek iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, plağın yüzeyini beş mililitre tripsin ile kaplayın ve plağı 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, hücreleri plaka yüzeyinden ayırmak için plağın yan tarafına hafifçe vurun. Trypsin'in plakanın dışına sıçramamasına dikkat edin. Şimdi plakaya beş mililitre medya ekleyin ve karışımı bir reaksiyon tüpüne aktarın.

Pelletleme işleminden sonra, pelletin bozulmamasına dikkat ederek medyum aspire edilir ve pellet 10 mililitre medyum içinde yeniden süspande edilir. Bir chamber slide'ın her bir odacığına 400 mikrolitre medyum ekleyin ve ardından her odacığa beş mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde gece boyunca büyümesine izin verin.

Hazne lamını inkübatörden çıkarın ve önceden hazırlanmış floresan işaretli ilgili patojenlerden her bir makrofaj haznesine 5 ila 10 µL pipetleyin. Pipetleme işlemini yukarı-aşağı yaparak makrofajlar ve patojenleri iyice karıştırın; bu sırada haznenin tabanına değmemeye ve yapışmış makrofajları rahatsız etmemeye dikkat edin. Dönen disk konfokal mikroskobun tüm bileşenlerini açın.

İmmerziyon objektif lensine yağ ekleyerek mikroskobu hazırlayın. Oda slaytını özel tablaya yerleştirin ve ardından DIC görüntüleme için mikroskobu hizalayarak oda slaytının üst kısmını çıkarın. Optik tuzak için obtüratörü ve IR lazeri açın.

Ardından, optik tuzağa giden lazerin shutter'ını açın. IR kartı ile kontrol ederek IR lazerin önündeki shutter'ın kapalı olduğunu doğrulayın. Şimdi yapışmış lam üzerindeki makrofajlara odaklanın.

Ardından, makrofajların bitişiğindeki çözelti içinde serbestçe yüzen patojenleri bulun. Bu prosedürün en zor kısmı, örnek haznesindeki nesne ile lamel camı arasındaki adezyon kuvvetleri nedeniyle örnek haznesinde takip edilecek doğru nesneyi bulmaktır. Nesneyi hareket ettirmek için, nesne trafik lazeri tarafından tutulurken sahneyi hareket ettirmeniz gerekir; ayrıca sahneyi, sahnenin sürükleme kuvvetinin tuzak tarafından uygulanan maksimum tutma kuvvetini aşmayacağı kadar düşük bir hızda hareket ettirmeniz gerektiğini belirtmek önemlidir.

Patojen tuzağın yakınında olacak şekilde sahneyi hareket ettirin. Ardından panjuru açın ve tuzağı devreye sokun. Makrofajların sabitlenmiş bir patojen görüntüsüyle temas etmesini sağlamak için örneği hareket ettirin.

Dönen disk konfokal mikroskop ile patojenler, DIC floresan veya her ikisinin kombinasyonu kullanılarak görüntülenmiş; tipik olarak yaklaşık beş mikron boyutundaki ayrı Candida albicans popülasyonları yeşil, mavi ve kırmızıya etiketlenmiştir. Görüntülemeyi örneklendirmek amacıyla, tek bir C. albicans yakalanmış ve gri oklarla belirtildiği gibi diğer maya kümesinin içinde kare bir desen çizerek hareket ettirilmiş; bu durum, operatör tarafından seçilen tek bir patojenin konumunun, kalabalık bir ortamda bile yakalama ve manipüle etme yeteneğini göstermiştir. Patojenik organizmaların sergilediği farklı şekil morfolojilerini yakalama konusundaki sistem esnekliğini daha ayrıntılı göstermek için bu şekilde, psödohifli bir C. albicans partikülünü tutmak ve konumlandırmak amacıyla optik cımbız kullanılmıştır.

C albicans kırmızı boya ile işaretlenmiş, beyaz okla belirtilen yörünge boyunca hareket ettirilmiş ve yeşil renkteki floresan GFPL C3 ham hücrelerinin yanına yerleştirilmiştir. Albicans'ın maya kısmı, psödohifler boyunca sürüklenirken hapsolmuştur.

Bu belirli hücre hattı ve patojen ile fagositozun kesin zaman çerçevesini analiz etmek amacıyla, Aspergillus fumigatus'un yanına ham bir fare makrofaj hücresi yerleştirilmiştir. Bu şekilde, parlak alan görüntüleri, beyaz okla belirtilen yakalanmış aspergillus'un, kırmızı okla gösterilen yol boyunca nasıl hareket ettirildiğini ve konumlandırıldığını göstermektedir. Yakalanan patojen, tuzağın organizmayı odak düzleminin biraz üzerine itmesi nedeniyle hafifçe odak dışıdır.

Aspergillus, istenen ham hücrenin yanına yerleştirilene kadar hareket ettirildi. Patojen hücre ile temas ettiğinde tuzak kapatıldı. Fagositoz süreci aktifleştirildi ve sonraki hücresel olayları gözlemlemek için zaman ayarlı görüntüleme yöntemi kullanıldı.

30. saniyede, ham hücrenin membranı değişmeye başladı ve partikülün etrafında bir çanak oluşturdu. 60. saniyede, çanak tamamen oluşmuştu. 90. saniyeden 150. saniyeye kadar Afu Gotti yutulmaya başladı ve 180. saniyede partikül tamamen içselleştirildi.

Bu videoyu izledikten sonra, döner diskli bir optik tuzak düzeneğinin nasıl kurulacağı ve bu tür bir cihazın, geliştirildikten sonra canlı hücre görüntüleme için patojenlerin invaziv olmayan şekilde kontrol edilmesine nasıl olanak sağladığı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, konakçı-patojen etkileşimleri alanındaki araştırmacıların, konak hücreler ile patojenler arasındaki uzaysal ilişkilerin rolünü ve bunun ardından gelen bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisini incelemelerine yol açmıştır.