Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım
13 Kasım 2011
Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, belirli beyin çekirdeklerinden toplam RNA'yı tekrarlanabilir, tutarlı, maliyet açısından verimli ve RNA'sız bir şekilde toplamaktır. Bu işlem, öncelikle RNA içermeyen bir çalışma ortamı hazırlanarak ve başı kesilmiş bir fareden tüm beynin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tekdüze boyutlarda seri doku kesitleri almak için mikrometre kontrollü bir doku kıyıcısı kullanılır.
Ardından, dokular RNA'dan arındırılmış bir ortamda tutulurken, belirli bir çapta doku çekirdeği kullanılarak ilgilenilen beyin bölgelerinin mikrodiseksiyonu yapılır. Son olarak, eksize edilen beyin çekirdeklerinden toplam RNA izole edilir. Nihayetinde, spektrofotometrik veya florometrik analizler aracılığıyla, aşağı akıştaki cDNA kütüphanesi hazırlama ve transkriptom profilleme işlemleri için yeterli toplam RNA verimi ve kalitesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu tekniğin, kaba anatomik veya lazer yakalama mikroskobisi destekli beyin bölgesi eksizyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tek bir fare beyninden ilgilenilen birden fazla ayrı beyin bölgesinin tekrarlanabilir ve maliyet açısından yeterli bir şekilde toplanabilmesidir. Bu yöntem, nöronal devrelerle ilişkili olmayan beyin bölgelerindeki farklı transkript ekspresyon profillerinin belirli davranışsal özellikler, çevresel yanıtlar ve/veya hastalık durumu ile ilişkili olup olamayacağı gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikrodiseksiyona hazırlanmak için, 100 mililitre Earl dengeli tuz çözeltisini veya EBSS'yi 0,44 gram sodyum bikarbonat ve 0,884 gram glikoz ile takviye edin.
EBSS'yi, vidalı kapaklı otoklavlanabilir bir şişe veya erlen içerisinde 0,1 mililitre DEPC ile en az 12 saat boyunca işleme tabi tutun. 37 °C'de. Beş üç çeyrek inçlik cam pipetleri bir litrelik cam behere yerleştirin ve kılları yukarı bakacak şekilde resim fırçalarını 100 mililitrelik cam mezür içine yerleştirin.
Pipetleri ve fırçaları örtecek miktarda DEPC işlem görmüş su çözeltisi ekleyin. Beheri ve dereceli silindiri alüminyum folyo ile kapatın ve 37 °C'de en az 12 saat inkübe edin; DEPC ile yapılan 12 saatlik inkübasyonun ardından, DEPC işlem görmüş tüm malzemeleri en az 15 dakika boyunca 100 °C'den daha yüksek bir sıcaklığa ısıtın. Soğutun. EBSS'yi 4 °C'de saklamadan önce oda sıcaklığına getirin.
DD H2O'yu beherin ve mezürün içinden dökün ve malzemeler kuruyana kadar 100 °C'nin üzerindeki sıcaklıkta inkübasyona devam edin. Bunları inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığına kadar soğutun ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. Deney günü, RNA kontaminasyonunu gidermek için tüm çalışma yüzeylerini temizleyin; EBSS'yi tamponlamak ve oksijenlendirmek için 40 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve orada tutun.
Gaz hortumlarını RNA içermeyen bir pastör pipetine yerleştirerek EBSS'yi %5 CO2 ve %95 oksijen ile doyurun. Pipeti EBSS'ye yerleştirip EBSS kabının ağzını kapatın. Beyin dokusunun seri kesitleri için bir doku dilimleyiciyi hazırlayın.
Doku dilimleyicinin üst ve alt yüzeylerini işleme tabi tutun. RNA kontaminasyonunu gidermek için, doku doğrayıcının pleksiglas yüzeyine dikdörtgen şeklinde bir parça watman Numara dört filtre kağıdı yapıştırın. Doğrayıcı koluna çift ağızlı bir jilet takın.
Mikrometreyi sıfıra ayarlayın ve jiletin filtre kağıdını kesmesine ancak pleksiglas plakaya zarar vermemesine izin verecek şekilde chopper kolunun minimum yüksekliğini düzenleyin. RNA içermeyen 60 by 15 millimeter hücre kültürü kapları, doku kozu, 200 microliter RNA içermeyen mikropipet uçları, kavisli makaslar, kuru buz ve doku toplama tüpleri dahil olmak üzere mikro diseksiyon için gerekli tüm ek malzemeleri toplayın. Bir kemirgen giyotini kullanarak bir fareyi dekapi̇te ettikten ve hem arka beyin hem de optik sinirler sağlam kalacak şekilde tüm beyni çıkardıktan sonra tüpleri kuru buz üzerine yerleştirin.
Beyni, 60 x 15 milimetrelik RNase içermeyen bir hücre kültürü tabağının üst kısmına yerleştirin. Ardından tabağı doku örnekleme çalışma yüzeyine aktarın. Doku kıyıcısına takılı olan filtre kağıdını, RNase içermeyen bir pipet kullanarak EBSS ile hafifçe nemlendirin.
Beyin dokusunu EBSS ile nemlendirin. Beyni doku doğrayıcıya aktarın ve ventral yüzeyi filtre kağıdına dayanacak şekilde konumlandırın. Orta hat doğrayıcı bıçağa dik olmalı ve beynin rostral kenarı bıçağa bitişik durmalıdır.
Beyni sabit tutmak için, beynin dorsal yüzeyine hafifçe bastırarak A-D-E-P-C ile işlem görmüş bir ressam fırçası kullanın. Bıçak tutucu kolunu dorsal doku yüzeyinin yaklaşık dört ila beş santimetre üzerine kaldırın ve bu konumda tutun. Fırçayı beyin yüzeyinden çekin ve 750 micrometers değerini ayarlayın.
Mikrometre kullanın. Kolu serbest bırakarak dokuyu kesin ve doğrayıcı bıçak sabitken 750 µm'lik bir koronal kesit oluşturun. Ressam fırçasını yuvarlayarak doku kesitini bıçak yüzeyinden nazikçe uzaklaştırın.
Doku kesitini hemen Petri kabındaki oksijenle zenginleştirilmiş EBSS içerisine yerleştirin. Bu kesit artık mikrodisseksiyon için hazırdır. Mikrodisseksiyonu gerçekleştirmek amacıyla, tüm rostrokaudal düzlem boyunca seri beyin kesitleri elde edilene kadar dilimleme prosedürünü tekrarlayın.
İlk olarak, örnek aydınlatmasının engellenmeyeceğinden emin olmak için ışıklandırmayı kontrol edin. Dokunun tamponlanmış oksijenli ortamını korumak için O2 CO2 karışımının konumunu ve akışını ayarlayın. Prosedür sırasında, ilgi bölgesini içeren koronal beyin kesitini belirleyin ve bir resim fırçası kullanarak bu kesiti Petri kabının tabanına düz bir şekilde yerleştirin.
Uygun çapa sahip doku örneği alma ucunu seçin. Koronal doku kesitini ressam fırçasıyla sabit tutun ve doku örneği alma ucunun kesme kısmını doku kesitinin yüzeyine doğru indirin. Baskı uygulayarak, doku örneği alma ucunu doku kesitinin içinden geçirip Petri kutusunun tabanına sıkıca bastırın.
İlgi bölgesinin çevre dokudan ayrıldığından emin olmak için yuvarlayıcı dairesel bir hareket uygulayın. Bir resim fırçası kullanarak doku örneğini doku kesitinden dikkatlice kaldırın ve mikro punch'ı EBSS içinde yüzmesini sağlayarak serbest bırakın. Doku mikro punch'ını derhal kuru buz üzerinde tutulan -80 °C'lik bir stabil saklama tüpüne yerleştirin.
Dokunun tüpün kenarına kolayca yapışması gerekir. Mikro örnek içeren tüpü kuru buza geri yerleştirin. Bu mikrodissection işlemini ilgilenilen her bir beyin bölgesi için tekrarlayın.
Mikrodiseksiyon tamamlandıktan sonra, her bir örnek içeren tüp için ilgili etiketi veya barkodları kaydedin. Doku örneklerinden RNA ekstraksiyonu yapmak için, RNA ekstraksiyonuna kadar doku örneklerini -80 °C dondurucuya yerleştirin. İlk olarak, RNA içermeyen bir çalışma alanı hazırlayın.
Toplam RNA izolasyon kiti kılavuzunda belirtildiği şekilde yeterli miktarda manyetik boncuk karışımı ve lizis bağlama solüsyonu hazırlayın. Doku örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve tüpleri doğrudan kuru buz üzerine yerleştirin. Bir örnek tüpüne 100 µL lizis bağlama solüsyonu ekleyin.
Pellet karıştırıcıya nükleaz içermeyen 0.5 mililitrelik tüp boyutunda bir havan ekleyin ve düşük tutunumlu nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak dokuyu homojenize edin. Homojenize edilmiş örneği, aynı tip uçla derhal yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu doku kültürü plağındaki bir kuyucuğa aktarın. Örneğe 60 µL %100 izopropanol ekleyin.
Örneğe 20 µL boncuk karışımı ekleyin ve pipetle üç ila dört kez yukarı aşağı çekerek karıştırın. Total RNA ekstraksiyonunu tamamlamak için total RNA izolasyon kiti protokolündeki adımları takip edin. Son olarak, elde edilen total RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu ölçün; çeşitli beyin bölgelerinden alınan mikro punchların total RNA verileri bu tabloda gösterilmektedir.
30 µL elüsyon tamponu ile elüye edilen RNA örnekleri, RNA dizileme uygulamaları için ticari olarak mevcut cDNA hazırlama ürünleriyle kullanmak üzere yeterli miktarda toplam RNA sağlamıştır. Ek olarak, RNA verimi ve 260/280 oranları, her bir beyin bölgesinden elde edilen okumaları göstermek amacıyla ilgili mikrodiseksiyon örneklerinden elde edilen tekil değerlerdir ve yüksek örnek saflığını doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında 8 ila 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, çalışma yüzeylerinin veya doku örneklerinin RNA kontaminasyonu riskini en aza indirmek için yalnızca RNA'dan arındırılmış veya DEPC ile işlem görmüş malzemelerin kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisine odaklanarak, fare beyninin belirli bölgelerinde RNA ekspresyon profili oluşturma protokolünü açıklamaktadır. Yöntem, yüksek kaliteli toplam RNA elde etmek için koronal beyin kesitini doku korer destekli mikrodissection ile birleştirir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Moleküler Biyoloji
- RNA Profilleme
Arka Plan
- RNA ekspresyon profillemesi, beyin fonksiyonlarının anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Ayrı beyin çekirdeklerinin doğru analizi için dikkatli diseksiyon gereklidir.
- RNA bütünlüğü için RNase'den arındırılmış bir ortamın sürdürülmesi esastır.
- Önceki yöntemler tutarlılık ve tekrarlanabilirlikten yoksundu.
Çalışmanın Amacı
- Fare beyin bölgelerinden RNA ekstraksiyonu için güvenilir bir protokol oluşturmak.
- Sonraki uygulamalar için yüksek verimli ve kaliteli RNA elde edilmesini sağlamak.
- Geliştirilmiş doku toplama yöntemleri aracılığıyla transkriptom profillemeyi kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- RNaz içermeyen bir çalışma ortamının hazırlanması.
- Farenin başının kesilmesi ve tüm beynin çıkarılması.
- Mikrometre kontrollü bir doku kıyıcısı kullanılarak beyin dokusunun tekdüze şekilde dilimlenmesi.
- RNA içermeyen bir ortamda, doku örneği kullanılarak hedeflenen beyin bölgelerinin mikrodisseksiyonu.
Temel Sonuçlar
- Diseke edilmiş beyin çekirdeklerinden yüksek verimli toplam RNA elde edilmiştir.
- RNA kalitesinin cDNA kütüphanesi hazırlığı için uygun olduğu doğrulanmıştır.
- Sonuçlar, yöntemin transkriptom profilleme için faydalılığını desteklemektedir.
- Analizler, sonraki uygulamalar için yeterli RNA kalitesini ortaya koymuştur.
Sonuçlar
- Taslak protokol, RNA ekstraksiyonu için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- Fare beyin bölgelerinden elde edilen RNA örneklerinin tutarlılığını ve kalitesini artırır.
- Bu yöntem, RNA analizi içeren gelecek nörobilim araştırmaları için faydalıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu mikrodisseksiyon yaklaşımı, lazer yakalama mikroskobisi ile elde edilen düşük RNA verimlerinin transkriptom profillemesini engellediği nörobilim hedef doğrulamalarındaki temel bir darboğazı çözerek, belirgin fare beyni bölgelerinden tekrarlanabilir ve yüksek verimli toplam RNA izolasyonuna olanak tanır. Yeni nesil dizilemeye uygun tutarlı bir RNA kalitesi sağlayarak, bu yöntem MSS hedeflerinin mekanistik risk analizini destekler ve erken keşif iş akışlarındaki öngörü güvenini artırır. Yöntem, preklinik hedef değerlendirmelerinde beyin bölgesine özgü gen ekspresyon çalışmaları için ölçeklenebilir ve maliyet açısından verimli bir alternatif olarak konumlanmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Transkript ekspresyonunu nöronal devre fonksiyonu ve davranışsal fenotiplerle ilişkilendirmek için belirli beyin çekirdeklerinden RNA izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fare başına birden fazla ayrı bölgeden tekrarlanabilir ve maliyet etkin numune toplanması sağlayarak hayvan kullanımını azaltır ve hedef risk azaltma sürecinde işlem kapasitesini artırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Beyin dokusu modellerinde gen ekspresyon taraması için güvenilir analiz geliştirilmesini sağlayarak, RNA-Seq ve qRT-PCR işlemleri için yeterli verim ve saflıkta toplam RNA sağlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek kapasiteli iş akışlarıyla uyumlu, manyetik boncuk destekli RNA izolasyonu kullanarak tarama kampanyaları genelinde standardizasyonu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değeri: Fare modellerinde hastalıkla ilişkili transkriptomik profillemeyi kolaylaştırarak, nöropsikiyatrik ve nörodejeneratif bozukluklardaki translasyonel biyobelirteç keşfi çalışmalarıyla uyum sağlar.
- Operasyonel Değeri: RNaz içermeyen protokoller aracılığıyla RNA bütünlüğünü sağlayarak, boylamsal preklinik çalışmalarda tekrarlanabilirliği ve laboratuvarlar arası veri karşılaştırılabilirliğini artırır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemesine kadar uzanan keşif sürecine uygundur; burada, beyin bölgesine özgü hassas RNA profillemesi, preklinik doğrulama öncesinde hedef seçimi ve önceliklendirme için bilgi sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Belirli nöral devrelerle bağlantılı ayrı beyin bölgeleri arasında transkriptomik karşılaştırmaya olanak tanıyarak yolak aydınlatılmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Kantitatif gen ekspresyon taraması için uygun standartlaştırılmış RNA girdileri üretir ve hedef etkileşim analizlerinde tekrarlanabilirliği artırır.
- Analitik: Spektrofotometrik ve florometrik kantifikasyon için yüksek kaliteli RNA üretir; böylece sekanslama ve PCR tabanlı uygulamalar için hassas girdi normalizasyonu sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Tanımlanmış beyin bölgelerinden hastalıkla ilgili transkriptomik veriler sağlayarak, keşif aşamasındaki ekspresyon profillemesini preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla nörobilim projesi ve hedef sınıfı için uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir doku koleksiyonu ve RNA izolasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hassas beyin bölgeye özgü ekspresyon verileri aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: RNaz içermeyen iş akışları ve minimum uygulamalı süre (örnek başına 8–10 dakika) ile tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Tek bir hayvandan birden fazla bölgesel örnek alınmasına olanak tanıyarak, amplifikasyon gerektiren düşük verimli yöntemlerle ilişkili maliyetleri düşürür ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: MSS ilaç keşfindeki go/no-go kararları için güvenilir transkriptom verileri sağlayarak riskle ayarlanmış hedef önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Diseksiyon ve RNA ekstraksiyonu sırasında örnek bütünlüğünü korumak için nöroanatomi ve RNaz-free teknik konusunda uzmanlık gerektirir.
- Mikrometre kontrollü bir doku doğrayıcıya, belirli çaplı doku korerlerine ve manyetik boncuk tabanlı RNA izolasyon kitlerine erişime bağlıdır.
- RNA kalitesinde çalışmalar arası tutarlılığı sağlamak için ekipler arasında standartlaştırılmış RNaz-free ortam protokollerini zorunlu kılar.
- Diğer beyin bölgelerine veya türlere adaptasyon, doku korer çapının ve kesme parametrelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Manuel doku zımbalama, otomatik lazer yakalama sistemlerine kıyasla ultra yüksek kapasiteli uygulamaları sınırlayabilir, ancak daha yüksek RNA verimi sunar.
