Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Bu prosedürün genel amacı, tekil nöronlardaki haberci RNA'ları saptamaktır. Bu işlem, patch clamp yöntemiyle tekil nöronların kaydedilmesi, ardından kaydedilen her nöronun sitoplazmasının tamamen aspire edilmesi, mRNA ve sitoplazmadan cDNA sentezlenmesi ve PCR ile amplifiye edilmesi yoluyla gerçekleştirilir.

Nihayetinde, reseptörler, iyon kanalları ve enzimler için spesifik mRNA'lar, geleneksel bir jel görüntüleme sistemi aracılığıyla tespit edilebilir. Benim adım [isim], University of Tennessee Health Science Center'da çalışıyorum. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tek bir nöronla elde edilen mRNA miktarı son derece düşük olduğu ve kolayca kaybolabildiği için zorluk yaşarlar.

Bu protokole, substantia nigra'nın orta rostral kısmını içeren 300 mikrometre kalınlığında koronal beyin kesitleri almak için bir vibratom kullanarak başlayın. Beyinler, 15 ila 40 günlük Sprague Dawley sıçanlarından izole edilebilir. Kesit alma işlemi; %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile oksijene edilmiş, pH değeri 7.4 olan yüksek sükroz içerikli bir kesme solüsyonu içinde buz gibi soğuk ortamda gerçekleştirilir; kesitleri, %5 karbondioksit ve %95 oksijen gazı ile havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı içerisinde inkübe edin.

Sıcaklığı 34 °C'de sabitleyin ve dilimleri orada 45 dakika bekletin. Ardından, kayıt aşamasına kadar beyin dilimlerini oda sıcaklığında tutun. Bir beyin dilimini patch clamp kayıt haznesine aktararak işleme başlayın.

32 °C'de oksijenlendirilmiş yapay beyin omurilik sıvısı ile sürekli olarak perfüze edilir. Yama pipetlerini, DNA ve RNA içermeyen su ile hazırlanmış ve otoklavlanmış hücre içi solüsyonla doldurun. Dolu pipeti banyoya indirin.

Direncin iki ile üç mega ohm arasında olduğunu kontrol edin. İlk olarak, substantia nigra'yı belirgin ve anatomik konumundan tespit edin. Ardından, namar optikleri ve 60 x objektif kullanarak, kayıt için SNC ve SNR'deki büyük hücreleri seçin.

Bunlar tereddütsüz bir şekilde olası dopaminerjik veya GABAerjik nöronlardır. Akım kenetleme ve voltaj kenetleme yapmak için geleneksel bir giga sızdırmaz mühürlü tüm hücre konfigürasyonu kullanın. mRNA degradasyonunu minimize etmek için bu kayıtlar genellikle beş dakikadan kısa sürede gerçekleştirilmelidir.

Sadece membran ve spike özelliklerini kaydederek, yaklaşık bir dakika içinde ilgili nöronlar için elektrofizyolojik parmak izleri sağlamak mümkündür. İlgili bir nörondan veriler elde ettikten sonra, sitoplazmayı aspire etmek için nazikçe ağızla vakumlama yapın. Sıkı sızdırmazlık bozulmamalıdır, aksi takdirde.

mRNA dahil olmak üzere hücre dışı kalıntılar, yama pipetine çekilebilir ve hücre içeriğini kontamine edebilir. Pipet ucunu kırıp hafif pozitif basınç uygulayarak hücre içeriğini 0.2 milliliter PCR tüpüne aktarın. İşlem tamamlandığında, mRNA içerebilecek hücre dışı kalıntıların kontaminasyon riskini ortadan kaldırmak için tüpü derhal -20 °C dondurucuya yerleştirin.

Herhangi bir aspirasyon uygulamadan, dokuya indirilmiş bir patch pipeti içeriğini toplayarak negatif kontrol oluşturun. 10 ila 20 nöron arasından hücre içeriğini topladıktan hemen sonra ters transkripsiyon reaksiyonuna başlayın. mRNA'ların degradasyonunu minimize etmek için, önce kontaminan genomik DNA'yı DNase ile 25 °C'de beş dakika boyunca sindirerek başlayın.

Bu adım, potansiyel yanlış pozitifleri azaltmak açısından kritiktir ve atlanmamalıdır. Ardından, DNA'ları 1,2 µL 25 mM EDTA ile inaktive edin ve örnekleri 70 °C'de beş dakika inkübe edin. Şimdi, genomik DNA'nın tamamen uzaklaştırıldığını doğrulamak için ticari olarak mevcut bir kit kullanarak cDNA sentezleyin.

Her örnek için ters transkriptaz içermeyen bir kontrol reaksiyonu yürütün. Bu sırada diğer tüm reaksiyon bileşenleri aynı kalmalıdır. Ürünleri, PCR tasarımı için gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.

Mümkün olduğunca Gen bank'taki dizilere göre primerler hazırlayın ve genomik DNA kontaminasyonunu tespit etmeye yardımcı olması için intronu kapsayan primerler tasarlayın. Primer çiftlerinin etkinliğini kontrol etmek için, ilk aşamada bunları tüm beyin cDNA'sı üzerinde test edin. Standart bir termal döngü protokolü kullanarak, 30 µL'lik cDNA'ların 5 µL'sini 35 döngü boyunca PCR ile amplifiye edin.

İkinci aşama için, ilk aşama PCR ürününün bir mikrolitresini aynı primer çiftiyle PCR ile çoğaltın ve hafifçe modifiye edilmiş bir döngü profili kullanın. Ardından ürünleri %2,5 AGROS jel üzerinde ayırın ve EtBr veya gel green kullanarak görselleştirin. UV ışığı altında, pozitif DNA bantlarını kesin ve DNA'yı toplamak için ticari olarak mevcut bir kit kullanarak bunları sekanslayın.

Substantia nigra'nın pars compacta ve pars reticulata bölgelerindeki nöronların elektrofizyolojik özellikleri karşılaştırılmıştır. SNR GABAerjik nöronlar, yaklaşık 10 hertz civarında daha yüksek frekanslı spontan spike'lar sergilemiştir. Spike'lar, hiperpolarize edici akım enjeksiyonu üzerine yaklaşık bir milisaniyelik bir taban süresine sahipti.

SNR GABAerjik nöronlar, zayıf bir aktive akımına işaret eden hafif bir SAG yanıtı göstermiştir. Buna karşılık, nigro dopaminerjik nöronlar, taban süresi yaklaşık üç milisaniye olan düşük frekanslı spontan spike'lar sergilemiştir. Dopaminerjik nöronlar ayrıca hiperpolarizasyona yanıt olarak belirgin bir SAG göstermiştir; bu durum, IH akımının SNR GABAerjik nöronlarda güçlü bir şekilde eksprese edildiğini, ancak dopaminerjik nöronlarda edilmediğini göstermektedir.

Tek hücreli R-T-P-C-R, GABA sentezinde anahtar bir enzim olan glutamik asit dekarboksilaz bir için mRNA tespit etti. Buna karşılık, tek hücreli R-T-P-C-R, dopamin sentezi için anahtar bir enzim olan tirozin hidroksilaz için mRNA'yı tanımlanmış SNC ve SNR dopaminerjik nöronlarda tespit etti, ancak GABAerjik nöronlarda tespit etmedi.

Ardından, voltaj kapılı potasyum kanallarının özelliklerini değiştiren voltajla aktive olan KV3 kanal alt birimlerinin ekspresyon profilini çıkarmak için tek hücre R-T-P-C-R kullanıldı. SNR gaba örneğinde, KV 3.1, 3.2, 3.3 ve 3.4 için nöron mRNA'ları yalnızca örnek bir S-N-R-D-A nöronunda tespit edildi. KV 3.2, 3.3 ve 3.4 ise havuzlanmış verilerde tespit edildi.

KV 3.1, SNR GABAerjik nöronlarda nigro dopaminerjik nöronlara göre daha sık tespit edilmiştir; bu durum, hızlı ateşleme yapan SNR GABA nöronlarında KV 3.1'in daha yüksek bir ekspresyon seviyesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, eldiven giymeyi ve araçlar geliştirildikten sonra bunları kontaminasyondan uzak tutmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların sinir sistemindeki reseptörlerin ve iyon kanallarının ekspresyonunu ve fonksiyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır.