Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model bir herpes virüsünün litik replikasyonunda bir konak sinyal yolunun rolünü çözümlemek için çeşitli virolojik ve biyokimyasal yaklaşımlar kullanmaktır. Burada bir örnek olarak, herpes virüs gamma HV 68 enfeksiyonu sırasında mitokondriyal antiviral sinyal proteini Mavs'in rolünü inceliyoruz. İlk olarak, akut enfeksiyon sırasında Mavs'in rolünü belirlemek amacıyla, vahşi tip ve Mavs nakavt farelere akut viral enfeksiyonu takiben gamma HV 68 enfeksiyonu uygulanır.

Fare akciğeri toplanır ve örneklerin seri dilüsyonları yapılarak plaklara ekildiği bir plak sayım testi ile viral yükler belirlenir. Ardından, monotabakalar üzerindeki plak sayısı sayılır. Knockout farelerdeki artmış viral yükler, ilgili genin antiviral bir rol oynadığını göstermektedir.

Buna karşın, nakavt farelerdeki azalmış viral yükler, genin viral enfeksiyon için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu bulguları doğrulamak amacıyla, fare embriyonik fibroblastlarında in vitro viral çok basamaklı büyüme kinetiği incelenir; yaban tipi ve mavs nakavt fare embriyonik fibroblastları gamma HV 68 ile enfekte edilir ve çeşitli sürelerle inkübe edilir. Ardından hücreler toplanır ve yaban tipi hücreler ile mavs eksik hücreler arasındaki çok basamaklı büyüme kinetiğini karşılaştırmak için plak analizleri gerçekleştirilir.

Bu bulguları daha fazla doğrulamak için, yaban tip ve mavs nakavt fare embriyonik fibroblast hücreleri gamma HV 68 ile enfekte edilir. Ardından, enfekte hücrelerden DNA ve RNA ayrı ayrı ekstrakte edilir ve viral genomik transkriptler real-time PCR ile analiz edilir. Bu protokolle ilgili fikri ilk olarak, bir virüs litik enfeksiyonu sırasında konak bağışıklık yolunun rolünü çalıştığımızda geliştirdik.

Bu protokol, diğer patojenlerin enfeksiyonu sırasında konakçı sinyal yolaklarının kurallarını araştırmak için potansiyel olarak uygulanabilir. Bu prosedüre, nakliyeden sonra altı ila sekiz haftalık, cinsiyetleri eşleştirilmiş ve aynı batından olan farelerin dört günlük bir süre boyunca adapte olmalarını sağlayarak başlayın. Aşağıdaki deney, biyotehlike tesisi bünyesinde gerçekleştirilecektir.

Hazırlık aşamasında, ikinci düzey bir biyogüvenlik kabininde çalışarak laboratuvar önlüğü, eldiven, maske ve galoş dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanları giyin. Enfekte edilecek her fare için 40 ila 10.000 PFU gamma HV 68 ve 30 µL steril PBS ile viral süspansiyonu hazırlayın.

Ketamin Xylazine intraperitonal enjeksiyonunun ardından viral süspansiyonu buz üzerinde tutun. Ayak parmağı sıkma testi yaparak farelerin sedatize olduğundan emin olun. Ardından bir pipet kullanarak, viral süspansiyondan 30 µL'yi sol veya sağ burun deliğine damla damla uygulayın.

Virüsün akciğerlere hava yoluyla iletimini kolaylaştırmak için fareyi beş ila 10 dakika boyunca yan yatırın. Ardından fareleri tekrar kafeslerine yerleştirin ve sedasyondan tamamen kurtulana kadar onları izleyin. Daha sonra, enfeksiyon sonrası çeşitli günlerde viral titreyi değerlendirmek için hücre lizatı hazırlamak amacıyla enjekte edilen farelerden akciğer dokusu toplanır.

Sakrifiye edilen farelerden alınan akciğerleri, buz üzerinde bulunan ve içerisinde 500 µL 1.0 mm zirkonya silika boncuk içeren steril 1.5 mL vidalı kapaklı tüplere yerleştirin. Bir sonraki adıma aynı gün geçilmeyecekse, örnekleri -80 °C'de saklayın.

Aksi takdirde, bir mililitre soğuk serumsuz DMEM ekleyin. Tüpü bir bead beater cihazına yerleştirin ve akciğerleri 30 saniye boyunca homojenize etmek için başlat düğmesine basın. Bu işlem, virüsü inaktive edebilecek numunenin aşırı ısınmasını önlemek içindir.

30 saniyelik homojenizasyonun ardından tüpü en az bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Ardından bu işlemi tekrarlayın. Sonrasında, homojenize edilmiş dokuyu dört santigrat derecede, 16, 000 RCF hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra, hücre kalıntıları tüpün dibinde, lipidler ise yüzeyde olacaktır. NIH 3T3 veya BHK 21 monokatmanını kullanarak plak assays testi gerçekleştirmek için süpernatantı burada gösterildiği gibi hemen alın. Ardından, örnekte bulunan viral titreyi belirlemek için plak assays testi yapılır; viral süpernatantın seri dilüsyonlarını hazırlayarak plak assays testine başlayın.

Önce çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu plakaya 270 µL besiyeri ekleyin. İlk sırayı boş bırakın. Ardından, 96 kuyucuklu plakanın ilk sırasına her örneği üç paralel şeklinde olacak şekilde 200 µL süpernatan ekleyin.

Ardından, ilk sıradaki örnekten 30 microliters miktarını bir sonraki sıraya aktarın ve karıştırın. Daha sonra, karışımın 30 microliters miktarını bir sonraki sıraya aktarın ve karıştırın. On katlı seri dilüsyonlar oluşturmak için bu adımı birkaç kez tekrarlayın.

Ardından, seyreltilmiş viral süpernatantı hücre monotabakasının üzerine ekleyin. 24 kuyuklu bir plakada. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve iki saatlik inkübasyon süresince her 30 dakikada bir plakayı sallayın; inkübasyonun ardından hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için plaktaki süpernatantı aspire edin.

Ardından hücreleri taze besiyeri ile bir kez yıkayın. Yıkama işleminden sonra, hücrelere metilselüloz içeren besiyeri ekleyin. Hücreleri dört ila altı gün boyunca inkübe edin.

Dört ila altı gün geçtikten sonra, her bir örnek için plak sayısını okumak için bir mikroskop kullanın. Her dilüsyon için plak sayısını kaydedin.

Ardından ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. Çok fazla veya çok az plak içeren kuyucuklar, titreyi doğru şekilde hesaplamak için kullanılamaz. Bu nedenle, her bir örnek için yedi ila 70 plak içeren bir dilüsyonu kullanın.

1000 kat sulandırılan bu numunede kuyu başına ortalama 23 plak bulunmaktadır. Sulandırılmamış çözeltideki viral titreyi hesaplamak için, sulandırma faktörünü, plak sayısını ve bir mililitredeki mikrolitre sayısını çarpın. Ardından, çıkan sonucu kuyu başına eklenen sulandırılmış süpernatan hacmine bölün.

Bu örnekte, 1000 çarpı 23 plak çarpı 1000 µL/mL bölü 100 µL, mililitre başına 2,3 × 10⁵ şeklinde kolon oluşturan birimle eşittir. Ardından, gamma HV 68'in fare embriyonik fibroblastlarındaki büyüme kinetiğini belirlemek için bilinen titreye sahip bir viral stok çözeltisi kullanılır. ORM'ler, yabanı tip fareleri ve belirli bir konak geninden yoksun olanları, kuyu başına 10.000 hücre olacak şekilde 24 kuyucuklu bir plakaya bölerek başlar. Ertesi gün, her kuyucuktaki ortam, 0,5 mL düşük MOI gamma HV 68 süspansiyonu ile değiştirilir.

Plakayı 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin ve inkübasyonun iki saat boyunca sürmesine izin verin. İnkübasyon sonrası her 30 dakikada bir plağı sallayın. Viral süspansiyonu uzaklaştırmak için bir pipet kullanın ve virüsle enfekte edilmiş hücrelere %8 fetal bovine serum içeren 0,5 mL taze complete DM EM ekleyin.

Hücreleri, enfeksiyondan sonraki çeşitli günlerde inkübatöre geri yerleştirin. Besiyeri sonu hücrelerini, pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekerek toplayın. Hücreleri steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve gamma HV 68'i hücrelerden salmak için tüpleri derhal minus 80 degrees Celsius'ta dondurun.

Üç kez dondurma ve çözdürme döngüsü gerçekleştirin. Hücreleri 37 °C'ye yerleştirerek çözdürün. Ardından vortekselemeden tekrar -80 °C dondurucuya yerleştirin.

Konak genlerindeki veya viral genlerdeki eksikliğin DNA veya RNA replikasyonunu etkileyip etkilemediğini incelemek için, daha önce gösterildiği gibi NIH three T three veya BHK 21 monokatman kullanılarak plak deneyi ile viral titreyi belirleyin. Enfeksiyondan sonraki farklı günlerde enfekte edilmiş hücrelerle başlayın, süpernatantı atın, hücreleri soğuk PBS ile yıkayın ve hücreleri tripsin ile ayırın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 1000 RCF'de bir dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün; santrifüj işleminin ardından süpernatantı atın ve hücreleri -80 °C'de saklayın.

Konak ve viral kökenli toplam DNA ve RNA'yı ekstrakte edin. Ardından spin kolonları santrifüjleyin. Toplam DNA'yı ve viral litik transkriptlere özgü primerleri kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.

Beta actin gibi bir konakçı housekeeping geni referans alınarak hücre içi gamma HV 68 genomunun bağıl miktarını belirleyin. Toplam RNA ve oligo DT primeri ile cDNA hazırlayın. Viral transkriptlerin bağıl miktarını belirlemek için yukarıda belirtilen cDNA ve primerleri kullanarak real-time PCR gerçekleştirin.

Burada gösterildiği gibi, konakçı housekeeping genine referansla, Mavs, mitochondrial antiviral signaling ifadesinin kısaltmasıdır. Mavs adaptör molekülü, NF kappa B ve ardından pro-inflamatuar sitokinlerin ve interferonların gen ekspresyonunu yukarı regüle eden interferon düzenleyici faktörleri (IRF'ler) aktive etmek için sitozolik rig eye benzeri reseptörlerden gelen sinyalleri iletir. gamma HV enfekte edilmiş wild type farelerin ve Mavs eksikliği olan kardeş farelerin akciğerlerindeki viral yükler burada gösterilmiştir.

Mavs eksikliği, enfeksiyondan 10 gün sonra akciğerdeki viral yükleri önemli ölçüde azaltarak, in vivo etkin viral enfeksiyon için Mavs'in gerekli olduğunu göstermiştir. Bu şekil, yabanıl tip fare embriyonik fibroblastları ile Mavs eksikliği olanlar üzerindeki viral çok basamaklı büyüme eğrisini göstermektedir. Fare embriyonik fibroblastlarında viral büyümenin önemli ölçüde gecikmesi, in vitro etkin viral replikasyon için Mavs'in gerekli olduğunu göstermektedir. Gamma HV 68 ile enfekte edilmiş fare embriyonik fibroblastlarındaki viral litik genlerin mRNA düzeyleri gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir; Mavs eksikliği, üç temel litik genin mRNA düzeylerini önemli ölçüde azaltmıştır.

Tüm bu sonuçlar toplu olarak, Mavs'in gamma HV 68 transkripsiyon aktivasyonu ve litik replikasyon için gerekli olduğu sonucunu desteklemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, hem VO hem de Vevo'da, konakçı-patojen etkileşiminin çoklu seviyelerde nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenlerle çalışmanın son derece riskli olabileceğini unutmayın.

Çalışmalar yürütülürken kişisel koruyucu donanım kullanımı gibi önlemler alınmalıdır.