Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu ^Düşük CD45 ^Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Bu video, konakçı düşük CD 45 negatif akciğer mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu için bir protokolü göstermektedir. Doku rezonan mezenkimal kök hücreler veya MSC'ler; doku onarımı veya rejenerasyonu, fibrozis, inflamasyon ve anjiyogenezin önemli düzenleyicileridir. İlk olarak, sakrifiye edilmiş bir fareden akciğerler diseke edilir.

Tek hücre süspansiyonu elde etmek için akciğer dokusu sindirilir. Hücreler hoax boyası ve CD 45 ile boyanır ve konakçıya özgü düşük CD 45 negatif akciğer MSC'lerini elde etmek için akış sitometrisi ile ayrıştırılır. Akciğer MSC'leri daha sonra kültürde genişletilir ve MSC farklılaşma kapasitelerini değerlendirmek için bir koloni oluşturma analizi gerçekleştirilir.

Daha sonra, MSC'lerin doku homeostazı ve hastalık sırasındaki rolünü incelemek için ek çalışmalar yürütülebilir. Burada gösterdiğimiz yöntem, fare veya insan akciğer mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için kullanılabilir ve pulmoner fibrozis, pulmoner hipertansiyon ve KOAH gibi akciğer hastalıklarının çalışılmasına uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, doku hazırlama için mevcut yöntemlerin çeşitliliğinin yanı sıra akış sitometre kurulumu için uygun kontroller ve analizler nedeniyle zorluk yaşayabilirler.

Sadece kelimelerle, hücrelerin optimum canlılığını sağlamak için akciğer dokusunun doğru kıyılma ve sindirilme tekniğini tarif etmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Ayrıca, akış sitometrisi cihazının kurulumu ve analizleri en iyi şekilde gösterim yoluyla aktarılabilir. Bu protokole, sakrifiye edilmiş yetişkin bir fareden mezenkimal kök hücreler elde etmek için kullanılacak olan akciğerleri çıkararak başlayın.

Farenin her iki yanındaki göğüs kafesini küçük ve keskin bir makas kullanarak lateral olarak kesin. Göğüs boşluğunu açın ve ardından diyaframı çıkarın. Sağ kalp ventrikülüne 20,5 gauge iğneye sahip 10 mililitrelik bir şırınga yerleştirin ve akciğerlerdeki kanı temizlemek için 3-5 mililitre PBS ile perfüze etmek üzere pistonu nazikçe itin.

Ardından, makas kullanarak trakeyi ve büyük bronşu kesin ve bunları atın. Sonra forseps yardımıyla, küçük beyaz akciğer loblarını alın ve Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.

Ardından kalbi çıkarın ve akciğer loblarını ayırın. Bu işlemi çalışmadaki tüm fareler için tekrarlayın. Akciğer loblarını kabın kapağına aktarın.

Dokuların kurumasını önlemek için üzerlerine yeterli miktarda HBSS püskürterek nemlendirin. Ardından, akış sitometrisi için sürdürülebilir kontrol olarak kullanılacak kemik iliğini elde etmek amacıyla, tek kullanımlık bir bistüri ile akciğer loblarını ince parçalara ayırın. Ayak bileğinden ve femur başından kesmek için bir çift keskin makas kullanın.

Uzvu yeni bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, femurdan doğrusal bir parça ve tibia ile fibulayı içeren ikinci bir parça kalacak şekilde dizek kısmını kesin. Pens yardımıyla, tibia, fibula ve femuru açığa çıkarmak için kasları sıyırın.

Şimdi, 26,5 gauge iğneye sahip beş mililitrelik bir şırınga alın ve iğneyi kemik iliği açıklığına yerleştirin. Tibianın bir ucundan kemiği tutun, diğer ucunu 15 mL HBSS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yönlendirin ve HBSS'yi boşaltıp kemik iliğini tüpe yıkamak için pistonu bastırın. Bu işlemi fibula ve femur ile tekrarlayın.

Kemik iliğini, takviye edilmiş yüksek glukozlu DMEM içerisinde final konsantrasyonu 5 µg/mL olacak şekilde host 3 3 3 4 2 boyası ile boyayın. Ardından, izole edilen dokudan akciğer dokusunun tek hücre süspansiyonu oluşturulacaktır. Her bir akciğeri, önceden ısıtılmış %0,2 Worthington içeren bir tüpe yerleştirin.

Steril HBSS içinde hazırlanmış tip iki kollajenaz ekleyin, ardından tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna daldırın ve 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sindirilmiş örnek pipetten kolayca akana kadar 10 mL'lik pipet ile tritürasyon yapın. Yaklaşık 10 tekrar gerçekleştirin ve doku sindirimini tamamlamak için 37 °C'de 15 dakika daha inkübe edin.

Sindirim işlemi tamamlandığında, hücre süspansiyonunu HBSS ile seyreltin ve kalan doku fragmanlarını tekrar dağıtmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, sindirilmemiş doku fragmanlarını uzaklaştırmak için süspansiyonu 70 mikromolar bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Numunenin hücre süzgecinden akışına izin vermek için süspansiyonu azar azar ekleyin.

Sindirilmemiş doku parçaları hücre süspansiyonunun akışını tamamen engelliyorsa, süspansiyonu yeni bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 450 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek peletleyin.

Santrifüj işleminden sonra süpernatantı dökün ve hücre peletini oda sıcaklığındaki kırmızı kan hücresi liziz tamponunda nazikçe resüspande ederek beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, liziz tamponunu inaktive etmek için eşit hacimde HBSS ekleyin.

Hücre süspansiyonunu, kalıntıları ve hücre agregatlarını uzaklaştırmak için 40 µm'lik bir hücre süzgecine dökün ve süzülen kısmı yeni bir 50 mL'lik konik tüpte toplayın. Ardından, bir hemositometre kullanarak hem akciğer hem de kemik iliği örnekleri için hücre sayılarını belirleyin. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve toplam hacmini kaydedin.

Ardından, tekli akciğer hücresi süspansiyonunu 450 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Hücreleri yaşatmak için, hem akciğer hem de kemik iliği hücrelerini önceden ısıtılmış takviyeli yüksek glukozlu DMEM içerisinde tek seferde 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

DNA'yı boyamak için, beş mikrogram per liter final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde HOAXED 3 3 3 4 2 boyası ekleyin. Ardından, hücreleri nazikçe ters çevirerek karıştırın ve tam olarak 90 dakika boyunca 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosunda inkübe edin. Sonrasında, 4 °C'de 450 ×g hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Akım sitometrisi ile analiz hazırlığı kapsamında, akciğer ve kemik iliği dokularının anti CD 45 ve propidyum iyodür ile boyama işlemine geçiniz. Hücreler boyandıktan sonra, tüpleri akım sitometrisi analizi gerçekleştirilene kadar ışığan korunmuş şekilde buz üzerinde saklayınız. Cihazın lazerlerinin hizalı olduğundan ve hücre ayıklama için yapılandırıldığından emin olarak akım sitometrisi için hazırlık yapınız.

Kullanılan cihaz; mavi 488 nanometre, kırmızı 635 nanometre ve UV 350 ila 355 nanometre lazerlerin yanı sıra, UV lazer yolunda mavi 45/65 ve kırmızı 675/50 filtreli iki detektöre sahip olmalıdır. Ek olarak, UV kırmızı detektör kırmızı sinyal için yüksek hassasiyete sahip olmalı ve cihaz, örneği 10 °C'de tutmak için bir soğutucu ünite (chiller) ile donatılmış olmalıdır. Cihaz yazılımında, doğrusal ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılımı (side scatter) görüntüleyecek histogram grafikleri ve cihaza uygun bir dublet ayırt etme (doublet discrimination) grafiği ayarlanmalıdır.

Log sinyal kullanan bir PI histogram grafiği, lineer sinyaller kullanan kırmızıya karşı mavi bir çizgi ve log sinyal kullanan bir CD 45 A PC histogram grafiği. Cihaz hazır olduğunda, boyanmış kemik iliği örneğini cihazın yükleme portuna yerleştirin. Bu örnek, boyama ve cihaz kurulum kontrolü olarak kullanılır.

Olayları toplamaya başlayın ve ileri yönlü iç saçılım (forward inside scatter) lineer sinyallerini ayarlayın. Hücre popülasyonunu net bir şekilde görselleştirmek için, hücreler, x ekseni olarak ileri saçılımın (forward scatter) bulunduğu grafiğin yaklaşık olarak alt orta kısmında yer almalıdır. Nükleer boya PI membran geçirgen olmadığı için, canlı hücreler tarafından dışlanacaktır.

PI histogramında PI pozitif ölü hücreler üzerinde bir kapı (gate) bölgesi çizin. Cihaz yazılımına, bu kapı içindeki ölü hücreleri kırmızıya boyamasını komut edin.

Konak G0 G1 popülasyonunu tanımlamak için navigasyon amacıyla renkli havalandırmalı ölü hücreleri kullanmak faydalıdır. PI boyası aynı zamanda UV lazer ile uyarılır ve ölü hücrelerin çoğunluğu ölçek dışında olmalıdır. Kırmızıya karşı mavi floresans grafiğinin sağ tarafında, kemik iliğinin G0 G1 popülasyonu, kırmızıya karşı mavi grafikte olayların sıkı bir kümesi olarak görülmelidir.

G sıfır G bir kümesini grafiğin merkezinin sağ üst kısmına yerleştirmek için dedektör voltajlarını ayarlayın. Hücre döngüsünün S-fazının bir kısmı ve G iki fazının tamamı ölçek dışında kalabilir. Kırmızıya karşı mavi hoax grafiğinin sağ üst kısmında, yan popülasyonun düşük değerleri, G sıfır G bir kümesinin sol tarafından grafiğin sol alt köşesine doğru uzanan bir iz şeklinde görülecektir.

Şimdi FSC'ye karşı SSC grafiğinde hücre kümesinin etrafına bir kapı (gate) çizin. Dublet grafiğinde belirlenen singlet popülasyonunu ve PI histogramındaki canlı hücreleri grafik üzerinde gösterin. Ardından, yalnızca bu kapılanmış popülasyonları görüntülemek için hoax grafiğini atayın.

Ana grafikte kapılama yaptıktan sonra, yan popülasyonun etrafına bir bölge çizin. Bu bölgeyi, hafif saçılım tekli hücre ve canlı hücre kapılarıyla birlikte CD 45 A PC histogramı için bir kapı olarak atayın. Sistem kurulduğuna göre, numuneyi yükleme portundan çıkarın ve akciğer örneğini yükleme portuna yerleştirin.

Bu örnek için cihaz ayarlarının tekrar düzenlenmesine gerek olmamalıdır. Kırmızıya karşı mavi hileli grafikte olayları toplamaya başlayın. Akciğer örneği için G zero G one kümesi genellikle x ekseni yönünde daha uzatılmış görünür ve klavyedeki tilda sembolüne benzer.

Yan popülasyon kapısı eşiği düşük seviyede olmalı ve kemik iliği örneği için ayarlanan konumla benzer bir konumda bulunmalıdır. Yan popülasyonun kesin çözünürlüğünü sağlamak için yukarı veya aşağı yönlü küçük ayarlamalar gerekebilir. Örnek akış valfinin çok fazla açılmadığından emin olarak sıralama sırasında düşük bir basınç farkını koruyun.

MSC'leri izole etmek için, sıralama odasına 96 kuyucuklu bir toplama plakası yerleştirin ve pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için CD 45 A PC histogramı üzerindeki sıralama kapılarını ayarlayın. Son olarak, hücreleri ya bir tüpe karışık popülasyon olarak ya da klonları izole etmek için 96 kuyucuklu bir plakaya tek hücreler halinde toplayın; hücre sıralama yoluyla akciğer MSC'leri toplandıktan sonra, hücreler %20 FBS ile takviye edilmiş A MEM kullanılarak 30 milimetrelik kaplara ekilir. İlk etapta, sıralanmış hücreler yaklaşık iki ila üç hafta sonra küçük, yuvarlak ve parlak görünür.

Mezenkimal fenotipe sahip koloniler belirginleşir ve her bir hücre hazırlığı için proliferasyon daha belirgin hale gelir. Akciğer MSC'lerin osteoblast, adiposit ve kondrosit gibi geleneksel mezenkimal hatlara farklılaşma yeteneğini ve kabul görmüş mezenkimal belirteçlerin hücre yüzey ekspresyonlarını değerlendirin. Kaba kromozomal anomalilerin olmadığını doğrulamak için sitogenetik bantlama analizi gerçekleştirin.

Akış sitometrisi ile izolasyon ve tek hücreli klonların oluşturulmasının ardından, MSC hücrelerini ve farklılaşma yeteneklerini karakterize etmek için bir koloni oluşturma deneyi gerçekleştirilir. Mililitre başına üç x 10⁴ hücreye seyreltilmiş hücreler ile başlayın. 100 milimetrelik kaplarda, eksiksiz kültür ortamı içerisinde, her kapta 10 mililitre ortam olacak şekilde üç tekrarlı olarak sırasıyla iki x 10⁴, üç x 10⁴, 1,5 x 10⁴ ve 0,75 x 10⁴ hücre olacak şekilde seri dilüsyon yapın.

Ardından, 10 günlük kültürden sonra plakları inkübatöre yerleştirin, besiyerini dökün ve hücreleri PBS ile durulayın. Sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca %100 metanol ekleyerek hücreleri sabitleyin. Beş dakika sonra metanolü dökün.

Ardından koloni oluşumunu tespit etmek için, iyonize su ile 1/20 oranında seyreltilmiş ağırlıkça %0,4 gza ekleyin ve 10 ila 15 dakika inkübe edin. Sonrasında boyayı dökün ve iyonize su ile durulayın. Örneklerin havada kurumasını bekleyin ve bir ters mikroskop veya görüntüleme yöntemi kullanarak, koloni başına 25 hücreden fazla içeren koloni sayısını belirleyin.

Koloniler burada gösterildiği gibi büyüktür, birkaç yüz hücreden oluşur ve mezenkimal bir fenotip sergiler. MSC'ler bu videoda gösterildiği gibi izole edilmiş ve büyüme simülasyonu için 96 kuyucuklu plakalara ekilmiştir. Ardından, durdurulmuş CFSE işaretli antijen sunan hücreler akciğer MSC'lerine eklenmiştir.

İzole edilen MSC'lerin proliferasyonu daha sonra, akciğer SC yokluğunda ve antijen sunan hücrelerin varlığında, bu şekilde gösterilen yalnızca CFSE işaretli T hücrelerinden oluşan arka plana kıyasla CFSE'nin ortalama floresan yoğunluğundaki azalma olarak ölçülmüştü; APC artı eksi OVA albümin CD 40 pozitif efektör T hücreleri, kırmızıyla daire içine alınan ve proliferasyonu belirten CFSE yoğunluğunda bir azalma göstermektedir. T hücresi membranındaki CFSE floresan yoğunluğu, her hücre bölünmesiyle ekonometrik olarak azalır, yani her bölünmede yarıya iner; akciğer MSC ve APC varlığında OVA CD 40 pozitif efektör T hücreleri, CFSE yoğunluğunda anlamlı bir değişim göstermez ve bu da proliferasyon eksikliğini belirtir. Bu teknik, akciğer kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, pulmoner arteriyel hipertansiyon ve pulmoner fibrozis gibi akciğer hastalıklarında mezenkimal kök hücrelerin rolünü keşfetmelerine yol açmıştır.

Bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra, bu prosedür takip edilerek yaklaşık beş saat içinde tamamlanabilir. Putatif akciğer mezenkimal kök hücrelerinin, kemik, yağ ve kıkırdak gibi uygun çoklu hat farklılaşma potansiyeli sergileyip sergilemediği dahil olmak üzere ek soruları yanıtlamak için farklılaşma analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.