Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Bu deneyin genel amacı, vasküler implantları otolog kan türevli endotelyal progenitör hücreler ile ekmek ve ardından bu tedavinin büyük bir hayvan modelinde tromboz üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu işlem, geç büyüme gösteren porcine endotelyal progenitör hücrelerini izole etmek için domuzlardan periferik kan örneği alınarak gerçekleştirilir. Ardından, implante edilebilir bir cihaz.

Kavram kanıtlama çalışmamızdaki titanyum tüp, otolog PC'ler ile yerleştirilmiştir. Cihaz daha sonra domuzun inferior vena cava'sına implante edilir. Sonuçlar, kontrol grubu ve tıkanmış çıplak metal tüpün aksine, EPC yerleştirilmiş titanyum tüpün açıklığına dayanarak trombose karşı koruma olduğunu göstermektedir.

Duke cerrahisi, çığır açıcı ve yenilikçi araştırmaları teşvik etmeye kendini adamıştır. Aşağıdaki sunum, tıbbı ilerletmek için departmanlar ve disiplinler arası nasıl çalıştığımıza dair bir örnektir. Dr. EK, vasküler cihazların kanla temas eden yüzeyini hastanın kendi progenitör hücreleriyle kaplayarak trombozu önleyecek bir hücre yerleştirme teknolojisi geliştirmek için yürütülen bir araştırma çalışmasına liderlik etmektedir.

Bu hücreler, implandı alacak olan hastaların kendilerinden türetildiği için bağışıklık sistemi tarafından reddedilme riskini önlemiş oluyoruz. Başarımız ve burada açıklanan yöntemler, geniş bir ekip çalışmasının sonucudur. Cerrahi implantasyon; damar cerrahisi bölümünden Sean Gage, Duke tıp öğrencisi Whitney Lane ve şahsım tarafından gösterilecektir.

Şimdi, hücre ekim sürecini ayrıntılı olarak anlatacak olan Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden doktora öğrencisi Alexander Janssen'i takdim etmek istiyorum. Bir domuz modeline implantasyon yapmadan hemen önce, titanyum tüplerin kana dayalı endotelyal progenitor hücreler ile nasıl ekileceğini göstereceğim. Bu yöntem bir kavram kanıtlama çalışması niteliğindedir ve aynı temel ilkeler, nitinol stentler ve mekanik dolaşım destek cihazları gibi diğer birçok implante edilebilir cihaza da uygulanabilir. EPC'ler, domuz kanının mononükleer hücre fraksiyonunun ekilmesiyle izole edilir ve genellikle yaklaşık yedi gün sonra ortaya çıkarlar.

Bu hücreler, tipik parke taşı morfolojileri ile tanınabilirler. EPC'leri kültürde toplam 9 milyon hücreye ulaşana kadar genişletin. Hazırlanan EPC'leri, etiketleme sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmalarını sınırlamaya dikkat ederek, serumsuz ortamda iki kez durulayın.

Ardından hücreleri floresan etiket PKH 26 ile kaplayın ve ne kadar solüsyon uygulandığını kaydedin. Hücreleri oda sıcaklığında dört dakika boyunca inkube edin. Bir dakika sonra boya solüsyonuna eşit hacimde domuz serumu ekleyerek etiketleme reaksiyonunu durdurun.

Birleştirilen çözeltileri, tam büyüme ortamı ile bire bir oranında seyreltin. Ardından sıvıyı aspire edin ve hücreleri üç kez tam büyüme ortamı ile, ardından iki kez yıkama ve kalsiyum veya magnezyum klorür içermeyen DPBS ile durulayın. Sonra, kullanılan hacmi kaydederek hücrelerin üzerini tripsin ile kaplayın ve 37 °C'de inkübe edin.

Üç dakikalık inkübasyonun ardından, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için mikroskopi kullanın ve eğer ayrılmışlarsa, eklenen miktarın iki katı kadar tripsin nötralizasyon solüsyonu ekleyin. Tripsini durdurduktan sonra, hücre solüsyonlarını tek bir tüpte birleştirin ve hemositometre ile hücre yoğunluğunu ölçün. Son olarak, hücre süspansiyonunu pellet haline getirin ve hücreleri en az 4.5 milliliters serumsuz ortamda yeniden süspanse edin.

Domuz ameliyata hazırlandıktan sonra, ikinci meme bezleri setinden başlayarak orta hattı 15 numara bistüri ucu ile kesin. Elektrokoter kullanarak sondan bir önceki sete kadar dikkatle ilerleyin. Diseksiyonu abdominal fasyaya kadar sürdürün.

Peritonyumu sivrisinek pensi ile kaldırın ve metz makas ile dikkatlice girin, idrar torbasını dışarı çıkarın ve torba duvarına 3-0 Vicryl kese dikişi atın. Merkezinde küçük bir insizyon yapın ve insizyondan içeriye 16 French Foley kateteri yerleştirin. Ardından, cerrahi sırasında idrar çıkışını saatte kilogram başına en az bir mililitre olacak şekilde titre etmek için intravenöz sıvılar uygulayın.

Ardından, genişlemiş ince bağırsağı dışarı çıkarın ve periton boşluğunun posterior kısmını açığa çıkarmak için iki adet bour cerrahi rektrakte yerleştirin ve keskin ve kör diseksiyon kullanarak IVC'yi tanımlayın. IVC'yi çevre dokulardan dikkatlice serbest bırakın. Daha sonra damarı, IVC bifurkasyonunun proksimalindeki sağ renal arterden distal uca kadar iskeletleştirin.

IVC diseksiyonu sırasında aşırı dikkatli olunmalıdır; çünkü IVC'deki çok küçük bir defekt bile hızlı hemorajiye ve hayvanın kan kaybından ölmesine yol açabilir. IVC segmentinin tüm yan dallarını ligatlayın; IVC bifurkasyonunun hemen proksimalindeki iki büyük posterior lumbal venin diseksiyonu ve ligasyonu sırasında özel özen gösterin. Posterior tarafta sıklıkla büyük bir lumbal ven bulunur.

Bu veni serbestçe disseke edin ve damar loopları ile kontrol altına alın. Şimdi, cerrahi ile paralel olarak, bu prosedüre başlamadan önce implantın EPC'ler ile ekimini yapmaya başlayın. Titanyum tüp doku yerleştirme iskeleleri tamamen monte edilmiş ve steril alanda kullanıma hazır olmalıdır.

Gaz sterilizasyonlu titanyum tüp düzeneğini beş cc'lik bir şırıngaya yerleştirin. Ardından, pistonu beş cc'lik şırıngadan çıkarın ancak atmayın; şırıngaya sabit bir kapak takın. Şırıngayı EPC süspansiyonu ile doldurmak için bir pipet kullanın.

Ardından pistonu geri takın. Kapağı çıkarın ve şırınganın giriş ucunu, tam oturana kadar düzeneğin açık silikon tüpüne yerleştirin. Daha fazla ilerletmeden, hücre solüsyonunu başlığın üst kısmına ulaşana kadar yavaşça sürerek tüm hava kabarcıklarını giderin.

Ardından düzeneği bir luer kapak ile kapatın ve steril bir eldiven içinde bantla mühürleyin. Bu düzeneğin tamamını işlenmiş bir şırınga tutucuya yerleştirin ve 37 °C'lik bir inkübatöre koyun. Oturma odacıklarının düz olduğundan emin olmak için bir kumpas kullanın ve düzeneğin hafif rotasyonla inkübe edilmesini sağlayın.

IVC ligasyonunun hemen ardından, domuz başına kilogram başına 100 ünite heparin uygulayarak cerrahiye devam edin. Ardından, IVC'yi distalde IVC ve lomber ven üzerinde 45 derecelik bir açıyla ve sonra proksimalde hemen klempleyin. Sonrasında, proksimal ve distal klempler arasında dört santimetrelik boyuna bir venotomi yapmak için 11 numara skalpel bıçağı ve pot makası kullanın.

IVC'deki tüm kanı tahliye edin ve iç lümenini steril DPBS ile yıkayın. Hücrelerin kurumasını önlemek ve havayı tahliye etmek için, EPC yerleştirilmiş implantı veya çıplak metal kontrolü IVC'ye yerleştirin. IVC'yi kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren DPBS ile doldurun.

Ardından venotomiyi 4-0 prolene sürekli dikişle kapatın ve IVC'deki havayı küçük bir miktar geri kanama yoluyla boşaltmak için proksimal klemplerden birini çıkarın. Kanama gerçekleştikten sonra, implantı yerinde tutmak için distal klempi çıkarın. Ven duvarından geçen PVC tüpüne bir askı dikişi uygulayın.

Fasyayı CT iğnesi üzerindeki OPDS ile kapatın. Subkutan alanı iki sıfır Vicryl ile sürekli dikişle kapatın. Ardından cildi zımba ile kapatın.

Ağrıyı önlemek için insizyon bölgesi boyunca cilt altına 20 mililitreye kadar %0,25 Marcaine uygulayın ve yarayı gazlı bez ve tegaderm ile kapatın. Gerektiğinde cilt altına flu Nixon ve oksimorfon verin. Anesteziyi sonlandırın ve domuz uyandığında, sonraki yedi gün boyunca onu kafesine geri döndürün.

Antibiyotik profilaksisi olarak her 24 saatte bir atri uygulayın ve cerrahi öncesinde uygulanan fentanil yamasının toplam üç gün boyunca yapışık kaldığından emin olun. Üç gün sonra, yerleştirilen titanyum tüp implantlar çıkarıldı ve iç yüzeyler incelendi. 550 nanometre eksitasyon dalga boyu altında, başka bir tüpte floresan işaretli hücrelerden oluşan konfluen bir tabaka tespit edildi.

Hücre sınırlarını görselleştirmek için kesit hücreleri ek olarak bir trombosit endotelyal hücre adhezyon belirteci ile boyanmıştır. Bu prosedürde çok çeşitli boyalar kullanılabilir. Buna karşılık, çıplak bir titanyum tüp implant, vena cava inferior'un protrombotik düşük paylaşım ortamında tamamen tıkanır.

Görüntü A ve C'de gösterildiği gibi, hücre yerleştirilmiş titanyum tüp görüntü B'de görülmektedir ve periferik kanla yapılan izolasyon prosedürümüzün ardından pıhtı oluşmadan kalmıştır. EPC'ler kültürde ortalama yedi gün sonra görülür. Cerrahi işlem sırasında, IVC'yi hem dikkatli hem de nazik bir şekilde iskeletleştirmek çok önemlidir; çünkü IVC'de veya yan dallarında meydana gelebilecek en küçük yırtılma bile domuzun kan kaybından ölmesine yol açabilir. Bu prosedürün ardından, trombozu önlemek için kanla temas eden diğer materyaller hızla endotelleşebilir.

Örneğin, EPC'lerimizle kaplanmış endotelyal vasküler stentler, kan damarı duvarının doğal astarını taklit eder ve geliştirilmesinden sonra stent restenozunu ve trombozu önleyebilir. Hızlı görme teknolojimiz, intravasküler cihazların hastanın kendi kanından elde edilen endotelyal progenitör hücrelerle ameliyathanede veya kateterizasyon laboratuvarında birkaç dakika içinde kaplanmasına olanak tanıyacaktır. Bu sayede, uzun süreli ex vivo kültür ihtiyacı ortadan kalkar.

Cihaz üzerindeki işlem süresi önlenmiş olur ve teknoloji, klinik uygulamaya aktarılabilir hale gelir.