Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Merhaba, ben Kara Ted, ben Leo. Ben de buradayım. Ve ben de Simon McQueen Mason.

Bitki biyokütlesinin sindirilebilirliği, günümüzde büyük ilgi gören bir konudur. Bunun nedeni, bu biyokütleyi oluşturan bitki hücre duvarlarının polisakkaritlerinde çok miktarda şekerin bağlı olmasıdır; eğer bu şekerleri kullanılabilir formda açığa çıkarabilirsek, bunları fermente ederek yakıtlar ve kimyasallar gibi her türlü ürünü üretebiliriz. Ne yazık ki, bu materyallerin sindirilmesi son derece zordur ve bu sindirilebilirliği nelerin kontrol ettiğine dair daha iyi bir anlayış geliştirmek aciliyet arz eden bir meseledir.

Yenileme grubu üretimi için bitki materyallerini kullanabilmek adına, bu bitkilerdeki şekerleştirme potansiyelini ölçebilmemiz gerekir. Bu nedenle York Üniversitesi'nde, şekerleştirme potansiyellerini belirlemek amacıyla geniş bitki materyali popülasyonlarını tarıyoruz. Şekerleştirme, çeşitli endüstriyel süreçler aracılığıyla değerli kimyasallar üretmek için kompleks karbonhidratların monosakkarit bileşenlerine parçalanması işlemidir.

Sakarifikasyon potansiyelini ölçmek için, açığa çıkan şekerleri belirlemek amacıyla biyokütleyi ön işleme ve enzim hidrolizine tabi tuttuğumuz endüstriyel süreçleri mikro ölçekli seviyede yeniden oluşturuyoruz. Bu işlem, genotiplerdeki ilgi çekici varyetelerin belirlenmesini sağlar. Yüksek verimli sistem, IG altı kuyucuklu plaka formatında çalışır.

Genotipler arasındaki ince farkları ortaya çıkarmak için hafif hidroliz koşulları kullanılır; bu yaklaşım aynı zamanda farklı substrat materyallerini desteklemek ve farklı enzimleri değerlendirmek için yeterince esnektir. Kullandığımız yöntem, bitki materyalinin toz haline getirilmesini, ardından 90 °C'de 20 dakika boyunca seyreltilmiş bir asit veya alkali ile ön işlemden geçirilmesini içerir. Ardından, ticari bir sellülaz karışımı kullanılarak 50 °C'de sekiz saat boyunca enzim sindirimi gerçekleştirilir.

Son olarak, indirgen şekerlerin salınımını belirlemek için bir MBTH yöntemi kullanılır. Bitki materyali, dört milimetrelik segmentler halinde kesilmiş kuru gövdeler olarak hasat edilir. Bunlar, üç adet beş milimetrelik metal bilye ile birlikte iki mililitrelik flakonlara yerleştirilir.

Flakonlar, örneklerin izlenebilirliğini sağlamak amacıyla taranan barkodlarla tek tek etiketlenmiştir. Örnekler, robotlar içerisindeki öğütme ve formatlama robotlarına yüklenir. Biyokütlenin 96 kuyucuklu plakaya dağıtılmasına olanak tanımak için örnekler otomatik olarak öğütülür ve karıştırılır.

Flakonlar delinir, ardından flakon, tozu dağıtmak için titreşen bir huninin içine yerleşecek şekilde robotik kolla yeniden konumlandırılır. Huninin titreşimi, kuyuk başına dağıtılan hedef kütle miktarını sağlamak için bir terazi tarafından düzenlenir. Biyokütle, plakaların 10 sütununa dağıtılır ve standartlar için iki sütun boş bırakılır.

Örnek başına dört tekrar yaparak, plaka başına 20 örnek yüklüyoruz. Bu plakanın hidrolizatı PCR plakalarına üç kez bölünerek üç optik plaka elde edilir. Bu sayede, biyokütle kuyucuğu başına indirgen şekerler için üç belirleme yapmış oluruz.

Formatlama işlemi tamamlandıktan sonra, buharlaşmayı önlemek için plakalar silikon bir mat ile kapatılır. Hazır hale geldiklerinde, sıvı aktarım robotuna aktarılırlar. Sıvı aktarım robotunda ön işlem, enzim hidrolizi ve açığa çıkan şekerlerin belirlenmesi işlemleri otomatik olarak gerçekleştirilir.

İki metrelik masa, gerekli farklı reaktifler için kapların yanı sıra plastik malzemeler için saklama alanı içerir. Ön işlem ve hidroliz için inkübatörlerin yanı sıra şeker tayini için termosayklerler mevcuttur. Ön işlem, derin kuyucuklu plakada gerçekleştirilir.

Biyokütle tozuna seyreltik asit veya alkali çözeltiler eklenerek gerçekleştirilir. Plakalar ısıtma bloğuna aktarılır ve 90 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edilir. Bu inkübasyon tamamlandığında, ön işlem 500 µL asetat tamponu ile beş kez durulanarak uzaklaştırılır.

Ön işlem durulandıktan sonra, bir enzim kokteyli eklenir. Bu standart bir karışımdır. Karışım, kuyuk başına 7 FPU konsantrasyonunda, dörtte bir oranında selüloz ve novozyme 1, 8 8 içerir.

Plakalar, çalkalamalı inkübatörde 50 °C'de sekiz saat boyunca inkübe edilir. Elde edilen hidrolizattan 75 µL bir PCR plağına aktarılır. PCR plaklarının 11. ve 12. kolonlarına glikoz standartları eklenir.

Ardından, tüm kuyucuklara 1 M sodyum hidroksitin 25 µL'si eklenir. Son olarak, PCR plakasına 50 µL MBTH reaktifi pipetlenir. Hidrolizatın üçüncü PCR plakasına aktarımı tamamlandıktan sonra derin kuyucuklu plaka saklanır.

PCR plakaları, 60 °C'de 15 dakika inkübasyon için termosikletörlere aktarılır. Sürecin son adımı, renk oluşumu için reaksiyon karışımının optik plakalara aktarılmasıdır. İnkübasyonun ardından PCR plakaları termosikletörden çıkarılır.

Aktarılan reaksiyon karışımına yüz mikrolitre yükseltgen reaktif eklenir. Renk gelişimini kolaylaştırmak için sıvı taşıma işlemi 24 saat içinde dört kez çalıştırılır; burada ön işlem durulaması ve enzim eklemesi yaklaşık iki saat sürer. Enzim hidrolizi sekiz saat, şeker tayini ise iki saat daha sürer.

İlk plaka sekiz saat boyunca inkübe edilirken, bir sonraki plaka işleme başlar. Robot kaynaklarının bu şekilde tahsis edilmesiyle, salınan indirgen şeker miktarını belirlemek için günde 80 örnekten oluşan üç setlik bir verimlilik elde edilir. Optik plakalar 620 nanometrede okunur.

Elde edilen sonuçlar, salınan şekerleri reaksiyon saati başına miligram başına nanomol cinsinden nicelleştirmek için analiz edilir. İzlediğiniz için teşekkürler; bunun biyoyakıtlar konusundaki araştırmalarınıza ilham vermesini dilerim.